ELISA檢測牛口蹄疫非結構蛋白抗體

索南卓瑪

（青海省同德縣畜牧獸醫工作站，同德 813200）

口蹄疫病毒（FMDV）的衣殼是20面的對稱體，由VP1、VP2、VP3和VP4共4種結構蛋白構成，除結構蛋白外，FMDV還有幾種非結構蛋白，包括前導蛋白酶2A、2B、2C、3A、3B、3C蛋白酶和3D聚合酶 及它們的前體（2種以上蛋白的復合體）。

采用疫苗的國家，大多數動物血清的FMDV結構蛋白和病毒感染相關抗原（VIAA既3D）抗體為陽性，因此，一些基于結構蛋白和病毒相關抗原的診斷方法，很難確定FMDV感染與否。目前，疫苗生產工藝在病毒純化過程中去除了大部分的非結構蛋白。因此，用滅活苗免疫動物體內的抗體產生，而沒有病毒非結構蛋白3ABC抗體產生，為此檢測FNDV非結構蛋白3ABC抗體的酶聯免疫吸附試驗（ELISA），不但可以檢測隱性感染動物，而且以區分感染動物和免疫動物，并能及時了解免疫動物的抗體水平，有效預防動物發生FMD，具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 3ABC基因表達蛋白包被ELISA板、洗板封閉、陰陽性對照、如果血清中有3ABC抗體，其即可與ELISA板上3ABC蛋白結合，形成抗原-抗體復合物，再與酶標二抗結合，加入底A、B、終止液。

1.1.2 疫苗 采用牛口蹄疫滅活疫苗，由中國威特生物科技股份有限公司生產的，批號為D10112J。

1.1.3 試驗動物 選用青海省大通縣引進的10頭野血牦牛進行FDMV滅活疫苗肌肉注射，3ml/頭，在首次免疫15 d后采取靜脈血，制備血清，進行FDM抗體檢測。

1.2 操作程序

1.2.1 對苯二甲酸丁二醇酯（PBST）用無離子水或蒸餾水做1∶25倍稀釋。

1.2.2 待檢血清樣品和陰陽性對照血清用稀釋液1∶21倍稀釋，（120 μl血清稀釋液加血清6 μl）每孔加入100μl陰陽對照血清樣品平行加2孔，用封口膜封口，37℃結合30min。

1.2.3 取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌5次，最后一次拍干。

1.2.4 用血清稀釋液按1∶100比例稀釋酶標二抗，每孔加入100 μl，用封口膜37℃ 結合30 min。

1.2.5 取掉封口膜，每孔加滿洗滌液洗滌5次，最后一次拍干。

1.2.6 將底物溶液A按1∶50比例稀釋于底物溶液B（1ml底物B中加入20 μl底物 A）混勻，每孔加入100 μl，用封口膜封口，37℃避光作用不超過10 min。

1.2.7 每孔加入100 μl終止液，注意要按加酶標二抗的順序加入終止液，應用酶標儀492nm波長測定吸光值（OD492值）。

2 結果判定

從圖1可以看出，本試驗通過10頭接種FMD滅活疫苗15 d后采取的牛血清，其NSP-ELISA平均OD492nm值為0.3805，標準差為0.0685，臨界值=0.3805+0.0685×3=0.5860。有8份血清OD492nm值超出臨界值，表明該I-ELISA對滅活疫苗免疫牛的特異性為96%以上。

3 結論

酶聯免疫吸附試驗是通過化學和免疫學的方法，將酶標記在抗原或抗體上，使其保持免疫學生物活性，當酶結合物與相應的抗體或抗原發生反應時，就可形成既有免疫學活性又有酶活性的“抗原-抗體-酶”的復合物，然后加入相應的酶底物，借助酶崔化的作用，無色的底物發生水解，氧化或還原反應等，形成有色的或電子致密的不溶產物。因此，從上述計算中可以看到，牛注射（FMD）滅活疫苗15 d后，檢測抗體效價存在與否。從血清非結構蛋白3ABC抗體的檢測結果表明，本次試驗建立的FMD-3ABC-I-ELISA不但存在免疫動物抗體的產生水平，而且對非結構蛋白中的3A、3B、3C自然感染抗體也具有重大的檢測意義，這次檢測的血清效價雖與之上述計算結果相吻合，有8份血清OD492nm值超臨界值，疫苗免疫牛的特異在96%以上，但在操作過程中還是要注意冰凍血清的融化均勻程度，血清稀釋液和底物平衡至室溫的應用等，以保證準確，減少試驗的誤差。

圖1 96孔酶標板檢測10份牛免疫血清樣品布局圖