腎癌中miR－210的異常表達及意義

周 亮，冷慧敏，2，翟慶娜，2，王 勇，孫 亮，李賢新，余振東，桂耀庭

（1.北京大學深圳醫院 男性生殖與遺傳重點實驗室，廣東 深圳518036；2.汕頭大學醫學院）

腎癌發生發展的分子生物學機制尚未完全清楚，探索腎癌的致病基因對于了解腎癌的發病機制有重要的意義。microRNAs（miRNAs）是普遍存在的、調節基因表達的短非編碼（約22nt）小分子調節RNAs，是由具有發夾結構的70－90個堿基的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成。1993年，miRNAs在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegants）中首次被發現［1］，人類基因組中編碼超過1000個miRNAs。其功能是調節特異性mRNA靶標活性，每一個miRNA可以抑制數百個mRNAs，在生理和病理過程中大范圍內發揮重要作用［2］。目前的研究證實約一半的miRNAs其上游基因位于染色體中與腫瘤相關的區域內，腫瘤的發生發展與miRNAs之間存在著錯綜復雜的聯系［3］。

本實驗室前期應用第二代大規模平行測序技術對10例腎透明細胞癌及其癌旁組織的microRNAs進行全基因組測序后發現：miR－210表達差異顯著，與其癌旁組織相比較平均上調約26倍。本研究應用熒光定量PCR技術比較miR－210在52例不同階段的腎細胞癌及其癌旁組織中表達量的差異［4］，用統計學方法分析miR－210表達量的差異與腎癌病理分期、年齡及性別的關系，以求發現新的診斷指標和新的治療腎癌的方法。

1 對象與方法

1.1 對象 收集北京大學深圳醫院、深圳市人民醫院、中山大學附屬腫瘤醫院泌尿外科等未經治療的原發性腎細胞癌患者手術切除的癌及其相應癌旁組織標本52例。所有標本均有完整的臨床病理資料，HE染色判定組織學類型，所有癌組織的相應癌旁組織為正常腎實質結構，無腫瘤細胞。所有病例均按照WHO分類標準進行診斷，病理分型和分期按照美國癌癥聯合會（AJCC）的TNM 分期進行［5］。腎癌臨床病理資料見表1。

每例標本留取3份組織：一份經4%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋；一份立即置于4℃RNA Later（Ambion）中，24h后置于－80℃保存待用；一份放于液氮。

表1 52例腎癌患者臨床病理資料

1.2 方法

1.2.1 前期測序及生物信息學分析 本研究組前期通過第二代大規模平行測序技術檢測腎癌組織與遠端癌旁組織差異表達的miRNAs和mRNA，發現表達上調和下調的miRNAs，其中miR－210在癌組織中顯著上調。

1.2.2 總RNA提取與逆轉錄 用Trizol法分別提取52例腎癌及其相應癌旁組織的總RNA。無RNA酶的DNA酶I處理，紫外分光光度計和1.5%的瓊脂糖凝膠檢測示質量好，無降解。按照逆轉錄試劑盒（Fermentas公司）說明書，取1μg總RNA，用BIO－RAD（UV－2450）的PCR儀上進行。

1.2.3 熒光實時定量PCR（Realtime PCR）檢測腎癌及相應癌旁組織中miR－210的表達量 采用miRNAs定 量 RT－PCR 檢 測 試 劑 盒 （miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒，Qiagen，Germany生產分別檢測52對腎癌及其癌旁組織中miR－210的表達量。上游引物由Invitrogen公司合成：5－CT－GTGCGTGTGACAGCGGCTGA－3；下游引物是由miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒提供的通用引物（詳見試劑盒說明書），反應在PRISM 7000實時定量PCR儀（Ambion）上完成。先將1μg總RNA反轉錄為第1鏈cDNA，以第1鏈cDNA為模板進行PCR擴增，擴增體系為：PCR Mix 10μl，引物0.8μl（0.2μmol／L），cDNA 1μl，ROX 0.4μl，ddH2O7.8μl；50℃ 2min，95℃ 2min，95℃ 15s，55℃20s，72℃30s，40個循環。U6snRNA作為內參照進行歸一化。miR－210在腎癌組織中的表達量的計算公式為：2－△CT，其中△CT＝CTmi－210－CTU6［6］。

1.3 統計學分析

應用SPSS10.0對數據進行統計學分析。對2－△CT的計算結果取對數［log2（x）］，得到的結果用－△CT表示。應用配對t檢驗對－△CT的結果進行數據分析，數據以均數±標準差（±sx）表示，以比較腎癌和相應癌旁組織中miR－210表達水平的差異。應用卡方檢驗分析其差異與腎癌病理分期、年齡、性別的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR－210在腎細胞癌及相應癌旁組織中的表達差異

2.1.1 總結分析前期數據 總結分析實驗室前期通過miRNA測序技術對10例腎透明細胞癌及其癌旁組織miRNAs測序的結果，發現miR－210在癌組織中的表達較癌旁組織表達上調約26倍。

2.1.2 RNA抽提和質控 組織總RNA用TRIZOL法抽提，提取后于1.5%瓊脂糖凝膠上樣電泳，紫外照膠儀下觀察，結果顯示5s，18s，28s條帶清晰，28s的亮度較18s高。同時紫外分光光度計檢測示 A260／A280值介于1.80－2.10之間，A260／A230值均大于2.00。

2.1.3 熒光實時定量PCR檢測miR－210在癌及相應癌旁組織中的表達差異 應用實時定量RT－PCR檢測52對不同階段新鮮腎癌及相應癌旁組織中miR－210的表達量，見圖1。miR－210表達量的計算公式為：2－△CT，其 中 △CT＝ CTmi－210－CTU6［6］。 對2－△CT的計算結果取對數 ［log2（x）］，得到的結果－△CT符合正態分布。經SPSS10.0分析得出miR－210在腎癌組織的平均表達量為－5.788 4±5.085 0，癌旁組織的平均表達量為－7.476 1±4.591 4。miR－210在腎細胞癌與癌旁組織中的表達差異顯著（P＝0.00），見圖2。

圖1 腎癌及相應癌旁組織mir－210表達的熒光定量PCR結果電泳圖

圖2 miR－210在52例腎癌組織及相應癌旁組織中－△CT值的分布情況

2.1.4 熒光實時定量PCR產物測序結果 取miR－210在腎癌及其相應癌旁組織熒光定量PCR的產物進行Sanger測序，測序結果與之前第二代大規模平行測序技術所得的序列一致，表明PCR擴增產物正確。

2.2 miR－210表達量與腎癌病理分型、分期、年齡及性別的相關性

miR－210以腎癌組織miR－210表達量的平均值－5.7884為界，將52例病例分為miR－210低表達組和miR－210高表達組［7］。再分別按照年齡（中位年齡48歲）分為≤48歲組和＞48歲組；按照性別分為男性和女性組以及按照 TNM 分期分為 T1－2N0M0組和T3－4N0M0 ＆ TXNXMX組。研究結果顯示：癌組織miR－210表達的高低與患者的年齡沒有相關性（0.30＜P）；癌組織 miR－210表達的高低與患者的性別沒有相關性（0.70＜P）；癌組織miR－210表達的高低與癌組織的TNM分期沒有相關性（0.50＜P），結果見表2。

3 討論

腎癌是一種高致死性泌尿生殖道腫瘤，是泌尿系統第二大腫瘤，且發病率每年增長2.5%。雖然，近年來腎細胞癌在影像學、外科治療和基礎醫學研究領域取得一定進展，但對于早期轉移的腎細胞癌患者而言，常規治療的應答率低（不超過25%）并伴有嚴重副作用。

表2 miR－210表達量與腎癌病理分期的關系

目前，miRNAs的表達和功能是腫瘤研究的熱點問題。有研究認為，遺傳或表觀遺傳的改變和與miRNA加工相關的基因及其蛋白的異常變化是miRNA表達異常的原因。主要的遺傳改變是染色體異常，超過50%的miRNA位于脆性位點，并且常常與癌癥相關［8］。Kort等研究認為腎母細胞瘤組織中miR－17－92簇過表達與轉錄因子E2F3活性增加有關。腎癌中低表達的let－7f是let－7家族成員，let－7在腫瘤中低表達是由于與其前體綁定的Lin－28和Lin－28BRNA結合蛋白抑制了let－7前體加工過程，導致其不能被加工為成熟的let－7，且負性調控RAS基因［9］。腎癌中高表達的miR－378通過抑制融合同源物抑制因子（sufs）與融合因子1（Fus－1）兩種腫瘤抑制基因的表達促進腫瘤的生長和血管的發生［10］。高表達的miR－421使N－Myc轉錄因子過表達促進腫瘤形成［11］。

VHL參與的低氧通路與腎細胞癌發生密切相關，有研究表明miR－210在缺氧細胞中表達顯著上調，對細胞生存至關重要［12］。2009年黃等人的研究發現miR－210表達依賴于HIF（缺氧誘導因子）－1α，此外，缺氧條件可以誘導miR－210在胰腺癌，乳腺癌，頭頸部腫瘤，肺癌，結腸癌和腎細胞癌細胞株中的表達，表明miR－210在啟動腫瘤發生過程中的重要作用［13］。最近的一項研究發現缺氧條件可以誘導腎細胞癌細株系7860表達miR－210，表明HIF－2α也可以調節的miR－210的表達［14］。以上研究意味著，HIF－1α可能是miR－210的最重要最直接的上游調控因子，可是當 HIF－1α缺乏時，HIF－2α也可以介導的miR－210的表達。通過靶基因3＇UTR熒光素酶檢測實驗驗證證實miR－210的靶基因為HOXA1，HOXA9和FGFRL1［15］。

本研究組前期利用miRNAs測序技術對10例腎癌及其癌旁組織提取的miRNAs進行測序并檢測其表達差異，發現miR－210在腎癌中的表達上調最為顯著。應用實時定量PCR對52例不同階段的腎細胞癌及其癌旁組織進行檢測，發現miR－210在癌組織中較相應癌旁組織中表達平均上調了7倍，由此證明miR－210對腎癌的發生和發展有著重要的作用。但進一步對表達量和臨床信息的分析顯示：miR－210的表達量與腎癌的病理分期、病人的年齡和性別并無顯著相關，這樣的結果可能與病例數目較少有關。本研究表明miR－210在腎癌發生過程中可能起到癌基因的作用，為腎癌的后續研究打下了良好的基礎。

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