α微管蛋白在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

劉青松，張科偉，薛夢華，李 智，劉 偉＊

（1.吉林大學白求恩第一醫院 胸外科，吉林 長春130021；2.第四軍醫大學唐都醫院 胸外科，陜西 西安710038）

α微管蛋白（α－tubulin）是細胞骨架的組成成分之一，在細胞有絲分裂和染色體分離中起關鍵作用［1］。有研究表明通過藥物作用微管蛋白能夠阻止腫瘤細胞的有絲分裂導致細胞進入凋亡期，從而抑制腫瘤生長［2］，因此微管蛋白在腫瘤的發生和發展中起重要作用。肺癌，特別是NSCLC是全世界癌癥死亡的主要原因之一，我國肺癌的發病率也在不斷攀升［3］，目前關于NSCLC與微管蛋白的研究主要集中在βⅢ－tubulin［4－6］，而關于α－tubulin的研究甚少。本研究通過組織芯片技術采用免疫組化方法檢測α－tubulin在NSCLC石蠟標本中表達狀況，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本組91例NSCLC石蠟組織切片取自1998年1月－2003年12月在吉林大學第一醫院胸外科行手術治療且隨訪資料完整的患者，所有病例均經術后病理明確診斷，術前均未接受化療、放療和其他治療。91例患者中男性67例，女性24例；年齡35－77歲，中位年齡61歲；非吸煙者36例，吸煙者55例；根據1997年國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control，UICC）NSCLC分期標準，Ⅰ期42例，Ⅱ期25例，Ⅲ期24例；病理類型中鱗癌53例，腺癌38例；隨訪截止日期為2008年4月8日，中位生存期為52±14個月。

1.2 組織芯片制備

91例NSCLC石蠟組織HE染色切片復檢后標記供體蠟塊靶點；利用組織芯片制作儀（Beecher Instruments公司），從供體蠟塊上穿取直徑為1mm組織芯2條，依次插入有200個點陣的受體蠟塊中制作組織芯片蠟塊；以5μm厚度連續切片，陣列切片置于60℃恒溫烤箱中烤片16h；組織芯片進行HE染色復檢合格后置于5℃冰箱內保存待用。

1.3 免疫組化染色

1.3.1 試劑 本實驗采用兔抗人多克隆α－tubulin抗體，購自Cell Signaling公司，適用于石蠟切片，二抗采用抗兔免疫組化檢測試劑盒（EnVision＋／HRP／Rb），DAKO抗體稀釋液，顯色劑二氨基聯苯胺（DAB）均購自DAKO公司。

1.3.2 結果判定 α－tubulin主要在細胞胞漿內陽性表達，α－tubulin陽性表達根據腫瘤細胞染色百分率與胞漿染色強弱（陰性＝0，弱陽性＝1，中陽性＝2，強陽性＝3）的乘積計算。兩者乘積≥200者為陽性高表達，＜200者為陽性低表達。（見圖1、圖2）

圖1 NSCLC鱗癌組織α－tubulin高表達（20×10倍數）

圖2 NSCLC腺癌組織α－tubulin低表達（20×10倍數）

1.4 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，α－tubulin高表達者與患者年齡、性別、吸煙狀況、病理類型、腫瘤分期等臨床病理資料的關系用Pearsonχ2檢驗或Fisher＇s精確概率法檢驗，生存率計算采用壽命表法并繪制Kaplan－Meier估計生存曲線進行單因素分析，經Log－rank檢驗后P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 α－tubulin在91例NSCLC樣本腫瘤細胞的胞漿中均存在表達，其中高表達者38.46%（35／91），低表達者61.54%（56／91）。≤55歲患者中α－tubulin高表達者顯著高于＞55歲患者（χ2＝6.267，P＝0.012），Ⅰ期和Ⅱ期高表達者顯著高于Ⅲ期患者（χ2＝4.280，P＝0.039），鱗癌中高表達者顯著高于腺癌（χ2＝4.067，P＝0.044）。α－tubulin表達與患者性別、吸煙狀況、腫瘤大小和淋巴結轉移程度無關（P＞0.05）。（見表1）

2.2 生存分析表明 α－tubulin高表達組中位生存期57個月，低表達組中位生存期35個月，兩組生存期未見統計學差異（P＝0.082）。但在≤55歲患者中，α－tubulin高表達組中位生存期76個月，低表達組中位生存期28個月，α－tubulin高表達者預后顯著優于低表達者（P＝0.011）（見圖3）。在鱗癌患者中，α－tubulin高表達組中位生存期80個月，低表達組中位生存期37個月，α－tubulin高表達者預后顯著優于低表達者（P＝0.023）（見圖4）。

表1 α－tubulin在NSCLC癌細胞胞漿中表達情況

圖3 年齡≤55歲患者α－tubulin低表達和高表達的生存曲線（P＝0.011）

圖4 鱗癌患者中α－tubulin低表達和高表達的生存曲線（P＝0.023）

3 討論

微管由α、β微管蛋白異源二聚體以及微管輔助蛋白組成，在微管組織中心中組裝為單管、二聯管（纖毛和鞭毛）、三聯管（中心粒和基礎小體）、紡錘體、基粒、軸突、神經管等結構［1］，參與維持細胞形態，細胞內物質轉運，有絲分裂，染色體分離等過程，尤其是微管不斷延伸和縮短的特有動力學，在細胞有絲分裂和染色體的分離起關鍵作用［7］。當腫瘤細胞增殖活躍時，有絲分裂處于活躍狀態，相應的微管蛋白異常表達。某些藥物作用于微管蛋白使微管動力學受到影響，腫瘤細胞無法形成紡錘體，使細胞分裂停止在G2期（DNA合成期），促進細胞凋亡，從而抑制腫瘤生長［2，8，9］，提示微管蛋白與腫瘤細 胞的增殖和凋亡有密切關系。本研究結果表明，α－tubulin在NSCLC中雖然存在非常廣泛的表達，但高表達者僅有38.46%，而且早期NSCLC患者顯著高于晚期患者，這與βⅢ－tubulin在卵巢癌中的表達截然不同，有研究表明βⅢ－tubulin高表達者卵巢癌的侵襲性更大且預后更差［10］。蛋白質發揮生物學功能不但與蛋白質的表達有關，也與蛋白質的轉錄后修飾有關，如α－tubulin和βⅢ－tubulin的轉錄后修飾機制不同，α－tubulin的轉錄后修飾與酪氨酸化、去酪氨酸化和乙酰化有關，而β－tubulin蛋白轉錄后修飾與磷酸化有關［11］，而且有研究進一步證明參與α－tubulin酪氨酸化作用的微管蛋白酪氨酸連接酶（Tubulin Tyrosine Ligase，TTL）對動物腫瘤和人類腫瘤起負調節作用，TTL蛋白表達降低與腫瘤的發生、侵襲和不良預后有關［12，13］。同時有研究發現，αtubulin和β－tubulin對微管的穩定性作用不同，αtubulin與三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）或二磷酸鳥苷－Pi復合物（guanosine diphosphate－Pi，GDP－Pi）結合后，在微管的 N－端結構區域形成“帽子”結構，使微管結構穩定；β－tubulin與GTP或GDP－Pi結合后，易被水解成GDP，引起微管解聚［14］，α－tubulin表達增高，微管穩定延伸，能夠抑制腫瘤細胞的有絲分裂，因此可能與NSCLC中α－tubulin高表達者腫瘤侵襲性較小，預后相對較好有關。本研究還顯示α－tubulin在不同年齡（≤55歲和＞55歲）、不同病理類型（鱗癌和腺癌）患者中表達存在顯著差異，這也提示α－tubulin在不同年齡和不同病理類型的NSCLC中的作用機制也可能存在顯著差異，值得更深一步的研究。

總之，本研究初步揭示了α－tubulin在NSCLC中的表達狀況及其臨床意義，隨著針對α－tubulin在NSCLC作用機制中的更深入研究，α－tubulin有可能在NSCLC診斷、分子靶向治療以及化學治療中成為非常有意義的生物標記物，從而更科學合理地指導NSCLC的臨床診療。

［1］Hammond JW，Cai D，Verhey KJ，et al.Tubulin modifications and their cellular functions［J］.Curr Opin Cell Biol，2008，20（1）：71.

［2］Sève P，Reiman T，Dumontet C.The role of beta III tubulin in predicting chemoresistance in non－small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2010，67（2）：136.

［3］Molina JR，Yang p，Cassivi SD，et al.Non－small cell lung cancer：epidemiology，risk factors，treatment，and survivorship［J］.Mayo ClinProc，2008，83：584.

［4］Umezu T，Shibata K，Kajiyama H，et al.Taxol resistance among the different histological subtypes of ovarian cancer may be associated with the expression of class III beta－tubulin［J］.Int J Gynecol Pathol，2008，27（2）：207.

［5］Sève P，Reiman T，Lai R，et al.Class III beta－tubulin is a marker of paclitaxel resistance in carcinomas of unknown primary site［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2007，60（1）：27.

［6］Aoki D，Oda Y，Hattori S，et al.Overexpression of class III betatubulin predicts good response to taxane－based chemotherapy in ovarian clear cell adenocarcinoma［J］.Clin Cancer Res，2009，15（4）：1473.

［7］Margolis RL，Wilson L.Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro［J］.Cell，1978，13（1）：1.

［8］Dumontet C，Sikic BI.Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents：microtubule dynamics，drug transport，and cell death［J］.J Clin Oncol，1999，17（3）：1061.

［9］Jordan MA，Wilson L.Microtubules as a target for anticancer drugs［J］.Nat Rev Cancer，2004，4（4）：253.

［10］Ferrandina G，Zannoni GF，Martinelli E，et al.ClassⅢ beta－tubulin overexpression is a marker of poor clinical outcome in advanced ovarian cancer patients［J］.Clin Cancer Res，2006，12（9）：2774.

［11］Banerjee A.Increased levels of tyrosinated alpha－，beta（III）－，and beta（IV）－tubulin isotypes in paclitaxel－resistant MCF－7breast cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，293（1）：598.

［12］Mialhe A，Lafanechère L，Treilleux I，et al.Tubulin detyrosination is a frequent occurrence in breast cancers of poor prognosis［J］.Cancer Res，2001，61（13）：5024－5027.

［13］Lafanechère L，Courtay－Cahen C，Kawakami T，et al.Suppression of tubulin tyrosine ligase during tumor growth［J］.J Cell Sci，1998，111（Pt2）：171.

［14］Nogales E.Structural insights into microtubule function［J］.Annu Rev Biochem，2000，69：277.