HIF－1α和VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥增生期內(nèi)膜中的表達(dá)及意義

趙 潔，薛素萍，曲銀娥＊，王春紅

（1.唐山市婦幼保健院 婦產(chǎn)科，河北 唐山063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

子宮內(nèi)膜異位癥（內(nèi)異癥，Endometriosis，EMs）是生育期女性的常見(jiàn)病［1］，HIF－1α（Hypoxia－inducible factor－1α）為核轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境，在大多數(shù)實(shí)體瘤中過(guò)表達(dá)，是腫瘤血管生成的始動(dòng)環(huán)節(jié)。VEGF是血管生成中的關(guān)鍵性促進(jìn)因子，是HIF－1α的靶基因之一。本研究采用免疫組織化學(xué)和 Western blot方法，研究 HIF－1α和VEGF蛋白在增生期的EMs異位及在位內(nèi)膜組織和正常內(nèi)膜組織中的表達(dá)，采用CD34標(biāo)記微血管密度，探討VEGF、HIF－1α及MVD之間的相關(guān)性，揭示HIF－1α和VEGF蛋白在EMs血管生成中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

選取2009年6月－12月就診于唐山市婦幼醫(yī)院、術(shù)后經(jīng)病理檢查證實(shí)為內(nèi)異癥的患者40例。取異位內(nèi)膜組織40例，年齡24－53（33.8±4.3）歲，同時(shí)通過(guò)刮宮或切開(kāi)手術(shù)取對(duì)應(yīng)的在位內(nèi)膜33例，年齡24－53（34.6±4.8）歲，對(duì)照組為同期因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)的36例正常子宮內(nèi)膜，年齡25－50（35.3±3.5）歲。根據(jù)月經(jīng)周期及病理所見(jiàn)劃分增生期和分泌期，所取內(nèi)膜組織均為增生期。所有入選對(duì)象月經(jīng)周期規(guī)律，術(shù)前3個(gè)月未應(yīng)用激素治療，無(wú)其它內(nèi)外科及內(nèi)分泌疾病。所有組織術(shù)后立即取材，部分液氮30min后－80℃保存，部分經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，1張行常規(guī)HE染色，余者用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人VEGF單克隆抗體為SANTA CRUZ公司產(chǎn)品，兔抗人HIF－1α單克隆抗體為Epitomics公司產(chǎn)品、兔抗人β－actin多克隆抗體為Sigma公司產(chǎn)品，鼠抗人CD34單克隆抗體、山羊血清、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2.2 SP法檢測(cè) HIF－1α和 VEGF蛋白 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以0.01mol／L PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知乳腺癌標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 免疫組化陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn) HIF－1α和VEGF陽(yáng)性信號(hào)為子宮腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒。通過(guò)Imageproplus圖像分析軟件，高倍視下選擇10個(gè)視野，測(cè)定每張切片中陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度（MOD）值，代表蛋白表達(dá)量。

CD34標(biāo)記的微血管判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù) Weidner［2］方法，以與背景有明顯區(qū)別的任何一個(gè)染成棕色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢作為一個(gè)血管，分支結(jié)構(gòu)只要不相連續(xù)也作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)。先在低倍鏡下選擇微血管密度最多的區(qū)域，再轉(zhuǎn)到×200倍率下計(jì)數(shù)3個(gè)視野的微血管數(shù)，取其平均值作為該例標(biāo)本的MVD。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)內(nèi)膜組織 HIF－1α和VEGF蛋白 將－80℃保存的異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜取出，加入組織裂解液后提取蛋白，BCA蛋白定量后上樣30μg，SDS－PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2小時(shí)，TBST洗膜10 min，加入 VEGF、HIF－1α 一 抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3×10min，加入二抗室溫孵育1－2小時(shí)，ECL顯色，掃描圖像經(jīng)分析軟件處理，結(jié)果與βactin蛋白表達(dá)水平相比較進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用SSPS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析及SNK法比較組間差異，指標(biāo)間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 VEGF蛋白主要在子宮腺上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中也有散在表達(dá)。免疫組化及Western blot統(tǒng)計(jì)結(jié)果均顯示：VEGF蛋白表達(dá)異位內(nèi)膜高于在位內(nèi)膜，而在位內(nèi)膜高于對(duì)照組內(nèi)膜，且各組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表1）。

表1 VEGF蛋白在各組內(nèi)膜的表達(dá)情況（±s）

表1 VEGF蛋白在各組內(nèi)膜的表達(dá)情況（±s）

注：與正常內(nèi)膜比較＊P＜0.01；與在位內(nèi)膜比較▼P＜0.01

組別 n 免疫組化（MOD） Western blot（VEGF／β－actin）36 0.096±0.013 0.290±0.031在位內(nèi)膜 33 0.179±0.015＊ 0.663±0.064＊異位內(nèi)膜 40 0.248±0.032＊▼ 0.777±0.057＊▼正常內(nèi)膜

2.2 HIF－1α蛋白陽(yáng)性反應(yīng)為棕黃色顆粒，表達(dá)于子宮腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)，異位內(nèi)膜高于在位內(nèi)膜和對(duì)照組內(nèi)膜，在位內(nèi)膜高于對(duì)照組內(nèi)膜，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Western blot檢測(cè)結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致（見(jiàn)表2）。

表2 HIF－1α蛋白在各組內(nèi)膜的表達(dá)情況（±s）

表2 HIF－1α蛋白在各組內(nèi)膜的表達(dá)情況（±s）

注：與正常內(nèi)膜比較＊P＜0.01；與在位內(nèi)膜比較▼P＜0.01

組別 n 免疫組化（MOD） Western blot（HIF－1α／β－actin）48 0.074±0.012 0.235±0.029在位內(nèi)膜 40 0.139±0.014＊ 0.645±0.058＊異位內(nèi)膜 56 0.189±0.026＊▼ 0.718±0.057＊▼正常內(nèi)膜

2.3 CD34定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃色，異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜組織的間質(zhì)中均有表達(dá)。異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜組織中MVD值分別為104.19±9.10、76.80±7.86和44.07±4.97，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 異位內(nèi)膜組織中VEGF、HIF－1α蛋白與 MVD Pearson相關(guān)分析顯示，異位內(nèi)膜組織中VEGF與HIF－1α、VEGF與 MVD及 HIF－1α與 MVD之間均存在正相關(guān)關(guān)系，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.972，P＝0.000；r＝0.903，P＝0.000；r＝0.890，P＝0.000）。

3 討論

EMs雖屬良性疾病，但具有侵襲、擴(kuò)散等惡性腫瘤的生長(zhǎng)特征，而血管生成在腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。VEGF是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)促血管生成因子之一，可特異性地與內(nèi)皮細(xì)胞上的Flt－1／KDR受體結(jié)合，刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，直接參與血管生成；也可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MMPs等多種組織蛋白酶和組織因子，降解細(xì)胞外基質(zhì)，有利于內(nèi)皮細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)，誘導(dǎo)血管生成。推測(cè)在內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，一方面VEGF增多，通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)、削弱基質(zhì)的屏障作用，使新生血管基底膜缺損加重，促進(jìn)血管生長(zhǎng)，利于異位內(nèi)膜的種植、存活；另一方面異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)可表達(dá)更多的VEGF，又進(jìn)一步促進(jìn)血管增生，形成了一種惡性循環(huán)。在內(nèi)異癥裸鼠模型中，外源性VEGF能促進(jìn)內(nèi)異癥病灶發(fā)生，而VEGF中和抗體或可溶性受體則可阻止種植灶形成，提示子宮內(nèi)膜在異位種植需要新生血管提供營(yíng)養(yǎng)［3，4］。Lu XE等［5］發(fā)現(xiàn)，從 EMs患者異位內(nèi)膜移植到小鼠腹腔內(nèi)的病灶，VEGF和 MMP－2的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，VEGF和 MMP－2可能會(huì)加速EMs的早期階段形成。

HIF－1α是一種介導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)微環(huán)境的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，該因子可以調(diào)節(jié)一系列基因和蛋白參與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。HIF－lα在子宮內(nèi)膜癌［6］等多種腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，提示腫瘤發(fā)生的全過(guò)程普遍存在缺氧現(xiàn)象并可誘導(dǎo)HIF－lα蛋白表達(dá)。HIF－1α作為低氧應(yīng)答時(shí)血管生成的主要的正性調(diào)節(jié)因子，可在上游基因水平調(diào)控VEGF等多種血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，直接參與血管生成的調(diào)控。在內(nèi)異癥發(fā)生的初期，由于新生血管沒(méi)有形成，缺乏相應(yīng)的血液供應(yīng)，必然會(huì)出現(xiàn)缺血、缺氧狀態(tài)，因此HIF－1α被大量激活。研究表明，異位內(nèi)膜 HIF－lα蛋白表達(dá)高于正常內(nèi)膜，提示HIF－lα的激活可能與內(nèi)異癥的發(fā)病密切相關(guān)［7］。張翠敏等［8］發(fā)現(xiàn) HIF－lα在內(nèi)異癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜表達(dá)均高于正常內(nèi)膜，但與r－AFS無(wú)關(guān)，提示HIF－1α在內(nèi)異癥早期缺氧狀態(tài)下高表達(dá)，而一旦新生血管形成，缺氧狀態(tài)得到改善，則 HIF－1α表達(dá)不再增加，表明 HIF－1α可能與內(nèi)異癥發(fā)生有關(guān)，而與內(nèi)異癥發(fā)展關(guān)系不大。

CD34為常用的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物之一，顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，其特異性高于VⅢ因子和CD31，且CD34抗體檢測(cè)所得MVD與患者的生存時(shí)間最具相關(guān)性。宋炯等［9］用免疫組化方法研究發(fā)現(xiàn)直腸癌組織中HIF－1α、VEGF蛋白表達(dá)和 MVD明顯高于正常對(duì)照組，且 HIF－1α、VEGF與 MVD的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn)，異位癥異位內(nèi)膜組織VEGF、HIF－1α蛋白及MVD均高于在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜，且VEGF、HIF－1α蛋白與 MVD呈正相關(guān)關(guān)系，與國(guó)內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者［10，11］的研究結(jié)果一致。推測(cè)HIF－1α在內(nèi)異癥早期的缺氧微環(huán)境中被激活，上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)，通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)等機(jī)制誘發(fā)了新生血管的生成，促進(jìn)內(nèi)異癥異位內(nèi)膜的黏附和侵襲。然而新生血管結(jié)構(gòu)不完善，如周細(xì)胞少、基膜薄、細(xì)胞間缺乏緊密連接等，易發(fā)生滲漏和出血，不但不能改善組織缺氧，反而誘發(fā)更多的生長(zhǎng)因子和新生血管形成，促進(jìn)內(nèi)異癥的進(jìn)一步發(fā)展。因此，HIF－1α與VEGF可能協(xié)同作用，共同促進(jìn)了內(nèi)異癥的血管生成。本研究果還發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組織中VEGF、HIF－1α蛋白及 MVD高于正常對(duì)照組，提示內(nèi)異癥在位內(nèi)膜的生物學(xué)特性不同于正常內(nèi)膜，發(fā)生了微觀改變。

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