超聲滅活后的國人成骨肉瘤細胞（OS－732）的超微結構變化

潘雪峰，徐長妍，孫新立，葛付濤，牛 豐＊

（1.吉林大學第一醫院 脊柱外科，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫院 病案室）

隨著針對骨肉瘤基礎研究的深入和保肢手術治療的開展，有效滅活骨肉瘤組織成為手術當中最為關鍵的一環，它直接關系到術后復發、遠處轉移以及生存率的問題。我們采用超聲滅活成骨肉瘤細胞（OS－732），觀察滅活后細胞形態和超微結構改變及細胞成活率，為臨床應用提供基礎研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 ①成骨肉瘤細胞（OS－732），購于北京積水潭醫院。②超聲波細胞粉碎機（JY92－Ⅱ寧波新芝科器研究所 輸出功率：0－1000W）。③MTT溶液。④透射電子顯微鏡等。

1.2 實驗方法 OS－732細胞長滿單層并處于指數生長期時消化并進行收集分組實驗。對照組：未采取任何方法處理。超聲滅活組：即采用超聲滅活的細胞組。①光鏡觀察：收集約1×105個細胞，離心后棄上清并用超聲滅活，然后用加樣器將細胞團吹碎涂于載玻片上，HE染色，在光鏡下觀察并攝片。②電鏡觀察：收集約5×108個腫瘤細胞，離心后超聲滅活。第一組超聲滅活的定時次數為75次；第二組超聲滅活的定時次數為150次。工作時間2s，間歇時間2s，輸出功率為400W。加入2.5%戊二醛固定。制作超薄切片后在透射電鏡下觀察。③MTT比色法測定對照組和滅活組細胞活性。

2 結 果

2.1 對照組細胞形態 光鏡下細胞主要為多邊形、三角形。胞漿輕度嗜堿性，細胞核較大、深染、異形性明顯。核染色質較粗，核仁大，核仁1－5個，可見病理分裂相。透射電鏡下可分為電子密度較高的“暗細胞”（圖1.A）和中等電子密度的“亮細胞”（圖1.B）兩種類型。細胞核大且不規則；核染色質分布均勻；核仁大，有時可見雙核仁；胞質內有大量的粗面內質網和較發達的高爾基復合體及大量分泌泡；線粒體數量較少；還可見多量核糖體及少量溶酶體。細胞表面有非常發達的微絨毛［1］。

2.2 超聲滅活組細胞形態

光鏡下HE染色后觀察，同對照組相比，鏡下含有兩種主要成分，一種為有形成分，主要以腫瘤細胞為主，可見到未被超聲擊碎的比較完整的腫瘤細胞，同對照組中的腫瘤細胞無顯著差異。還可見到細胞膜被超聲擊碎的腫瘤細胞，細胞核脫離細胞膜及細胞質，游離在鏡下。另一種為無形成分，為被超聲擊碎的細胞碎片，無任何結構及形態，無法辨認其原始結構。

Fig.1 Ultrastructure features of OS－732cells under normal culture conditions.Cell structure，such as nucleus，chromosome and double pathological nuclears can be cleary seen

透射電鏡觀察表明，經75次超聲滅活后，細胞形態和內部結構同對照組相比出現明顯差異。經75次超聲作用后，可見鏡下含有兩種主要成分，一種為有形成分，主要以腫瘤細胞為主，可見到未被超聲擊碎的比較完整的腫瘤細胞，同對照組中的腫瘤細胞無顯著差異。胞核內可見到正常的核仁、核染色質，核膜無明顯變化，胞漿內可見到正常的粗面內質網、高爾基氏復合體、線粒體、核糖體、溶酶體、分泌泡等細胞器成分。細胞膜結構無顯著變化。還可見到細胞膜被超聲擊碎的腫瘤細胞，細胞核脫離細胞膜及細胞質，游離在鏡下，其結構同對照組的細胞核相比無明顯差異。另外還可見到正常的細胞器成分因細胞膜破裂而游離在鏡下，其結構同對照組的細胞器相比無明顯差異。另一種為無形成分，為被超聲擊碎的細胞碎片，無任何結構及形態，散在于細胞間，無法辨認其原始結構。擊碎的細胞已無法保存其內環境，從而導致不可逆性損傷。（圖2.A，圖2.B）

Fig.2 Ultrastructure features of OS－732cells treated by ultrasound 75periods.Broken cells and fragment can be seen compared with contrast cells

光鏡下HE染色后觀察，同對照組相比，鏡下主要為無形成分，無法找到具有細胞形態的細胞樣結構，均為被超聲擊碎的細胞碎片，無任何結構及形態，無法辨認其原始結構和來源，同75次超聲滅活組中的無形成分相一致。

透射電鏡觀察表明，經150次超聲滅活后，細胞形態和內部結構同對照組和其它滅活組相比出現明顯差異。經150次超聲作用后，鏡下全部為無形成分，無法找到具有細胞形態的細胞樣結構和細胞器成分，均為被超聲擊碎的細胞碎片，無任何結構及形態，無法辨認其原始結構和來源，同75次超聲滅活組中的無形成分相一致。細胞已形成不可逆性損傷［1］。（圖3.A，圖3.B）

Fig.3 Ultrastructure features of OS－732cells treated by ultrasound 150periods.Only cell fragments can be seen compared with contrast cells

2.3 MTT比色法 沒有檢測到滅活后培養細胞的A值，證明骨肉瘤細胞已經有效地被滅活。

3 討論

超聲屬于熱滅活腫瘤的一種方法，被認為是最有希望的治療腫瘤的新方法之一［2，3］。采用超聲治療腫瘤的理論基礎之一是認為某些腫瘤較正常細胞對超聲更加敏感。在體和離體的實驗均表明，超聲可以殺滅腫瘤細胞，破壞腫瘤組織，抑制腫瘤組織增殖［2］。特別是近年來以HIFU為代表的高強度聚焦超聲（High Intensity Focused Ultrasound，HIFU）治療體內癌腫裝置的改進和對其生物學效應研究的深入，被認為是超聲治療腫瘤的趨勢。

3.1 超聲滅活骨肉瘤細胞（OS－732）的形態學改變的分析 經超聲處理后的OS－732，光鏡和透射電鏡下觀察，主要含有兩種成分，一種為有形成分，主要以腫瘤細胞為主，可見到未被超聲擊碎的比較完整的腫瘤細胞。還可見到被超聲擊碎的腫瘤細胞，細胞核脫離細胞，游離在鏡下。另一種為無形成分，為被超聲擊碎的細胞碎片，無任何結構及形態，無法辨認其原始結構。75次超聲滅活組中兩種成份均可見到，而150次超聲滅活組中則以無形成分為主，無法找到有形成分，經MTT法檢測細胞無任何活性。這充分說明這兩種方法能夠有效地對骨肉瘤細胞進行滅活，特別是150次超聲滅活后細胞被完全擊碎，能夠更徹底地將腫瘤細胞殺滅。

3.2 超聲滅活腫瘤機理的探討 通過本次實驗證實超聲能夠有效地將腫瘤細胞擊碎，故對其抗癌機制的探討和闡明十分必要。

①熱效應 一般認為熱機制在超聲治療腫瘤中起主要作用。雖然組織內溫度上升受多種因素影響，但卻與組織吸收能量成正比，當組織溫度升至50－60℃時，由于蛋白質變性，可致生物組織明顯變化，表現為凝固性壞死［2－5］。在 HIFU 治療時，焦域內溫度幾秒內即可達100℃，而43℃以上足可以致腫瘤細胞不可逆性損傷。

②空化效應 空化作用可致生物組織內自由基產生而損壞生物組織，經超聲沖擊波和空化聯合作用之細胞增殖能力、DNA合成能力均明顯低于正常對照組［6］，甚至是細胞被完全擊碎，完全找不到正常細胞結構而無任何細胞生物功能。因此，空化效應是超聲致死腫瘤過程中又一起主要作用的因素。

③對化學治療的增強作用 化療仍是目前惡性腫瘤治療的重要手段，提高化療效果和降低其副反應是許多研究想要解決的問題［7－11］。腫瘤細胞內藥物的聚集是較為重要的因素之一。細胞膜通透性的增加有助于藥物進入細胞內，超聲處理能夠通過壓力波使膜通透性增強，使一些大分子物質進入細胞漿［12］。超聲的焦點處即有這種壓力，起到這種作用［7］。膜通透性增加的原因還可能與空化效應對細胞膜的損傷有關，特別是使用頻率較低超聲波時，更易產生空化作用［13］。腫瘤組織DNA修復能力增強是其耐藥機制之一［14］。在研究超聲對腫瘤細胞DNA合成時的影響時發現，0.5w／cm2和1w／cm2能抑制Ehrlich腹水瘤細胞DNA的合成，而0.1w／cm2則能夠刺激DNA的合成，但它對DNA的修復合成（Unschedulated DNA Synthesis）并無明顯影響［15］。此既提示采用超聲治療腫瘤需足夠的強度，也提示超聲治癌并不誘使腫瘤細胞產生對化療的多藥耐藥性。

④免疫機制 此機制尚不明確，也正是超聲治療學中亟待闡明的問題。有學者認為是由于高溫固化留置瘤苗的作用，一方面，超聲破壞癌腫，使瘤／宿主優勢得以改善，另一方面，高溫使癌組織變性，腫瘤組織抗原性改變，更易刺激機體免疫。腫瘤局部熱療與免疫關系的研究發現，高熱可促進腫瘤組織合成熱休克蛋白（HSP），HSP可刺激機體免疫系統，提高機體免疫功能［16］。

與此同時，經微波滅活后的保肢術能夠保留關節的正常功能，術中減少血行播散和局部擴散，提高患者的免疫功能，從而提高了患者的生存率和生活質量，是目前很好的治療骨腫瘤的方法。

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