應用RT－PCR和熒光原位雜交監測急性早幼粒細胞白血病微小殘留白血病

張 濟，李 羿，李君君，顏家運，劉 靜

（1.南華大學附屬第一醫院 血液科，湖南 衡陽421001；2.中南大學湘雅醫學院分子生物學研究中心，湖南 長沙410078；3.空軍雷達學院宜昌校區衛生隊，湖北 宜昌443111）

急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是一種特殊類型的急性白血病，發病率占急性白血病的6%－9%，在中國人群中約占急性髓系白血病的12%－23%［1］。70%－90%的APL具有特征性的染色體易位t（15；17）（q22；q12）及其產生的PML－RARα融合蛋白，是APL特有的分子遺傳性學標志。此類白血病細胞可被全反式維甲酸（all trans retinoic acid，ATRA）誘導分化成熟，國內外許多研究學者［2－4］研究報道ATRA 和As2O3聯合治療急性早幼粒細胞白血病，可有效根除白血病細胞的惡性克隆，完全緩解率（CR）達85%－90%。本研究通過RT－PCR和熒光原位雜交技術檢測ATRA及As2O3聯合治療APL后體內PML－RARα融合基因的表達水平變化，監測APL患者體內微小殘留白血病的情況，為及時臨床用藥及預后評估提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 對象 20例正常對照組為健康人群，男13人，女7人，年齡在15－62歲，中位年齡為38歲。46例APL患者為2008年6月至2010年6月我院診治的病人，APL的診斷均依據FAB的診斷標準［5］，其中男26例，女20例，年齡16－65歲，中位年齡38歲。

1.2 治療方法 將0.1%As2O3注射液10ml加入50g／L葡萄糖溶液500ml中，靜脈點滴，持續4－6h；ATRA 25mg.m－2.d－1，口服，直至達完全緩解（CR）。完全緩解（CR）后再接受3個療程化療。

1.3 熒光原位雜交檢測PML－RARα融合基因采用北京金菩嘉公司提供的雙色雙融合DNA探針，實驗操作參考操作說明及文獻資料［6］進行，結果觀察在OLYMPUS－BX51型熒光顯微鏡下觀察計數1000個細胞。正常細胞信號顯示方式為2紅2綠，PML－RARα融合基因融合基因陽性細胞為2紅1綠1黃。

1.4 RT－PCR 檢測 PML－RARα融合基因 采用TRIZOL試劑嚴格按操作說明提取患者總RNA，采用cDNA合成試劑盒進行逆轉錄反應，采用一對特異的PML－RARα融合基因引物擴增該融合基因，上游引物：5＇ACCGAT GGCTTCGACGAGTTC 3＇，下游引物：5＇AGCCCTTGCAGCCCTCACAG 3＇；PCR參數設置為：94℃變性35秒，55℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，反應30個循環，最后1周期后72℃延伸10分鐘，PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 統計學處理 運用SPSS13.0統計軟件進行分析，數據資料采用配對四格表資料檢驗（Mc－Nemar test）進行差異分析，檢驗水準為α＝0.05。

2 結果

2.1 治療前骨髓細胞形態學與PML－RARα融合基因檢測

46例患者初診時骨髓細胞學檢查為典型的APL骨髓象，異常早幼粒細胞占骨髓有核細胞的78.4±16.2%，RT－PCR及 FISH 技術檢測 PMLRARα融合基因均為陽性，其中2例初發患者因并發彌散性血管內凝血（DIC）搶救無效死亡。

2.2 微小殘留白血病的檢測

2.2.1 誘導緩解后 PML－RARα融合基因的檢測

經全反式維甲酸和三氧化二砷聯合治療后骨髓象達到完全緩解，其中34例APL患者PML－RARα融合基因檢測結果見表1，25例經RT－PCR和FISH檢測均呈陰性，1例患者緩解后未能嚴格按化療方案堅持治療，疾病復發而死亡，另外1例患者失去隨訪資料，其余病人一直處于緩解狀態，因此該融合基因陰性復發APL的預測值為4.3%。9例PML－RARα融合基因陽性患者，3例FISH檢測呈陰性，FISH的陽性檢測失敗率為33.3%；1例RTPCR檢測呈陰性而FISH檢測呈陽性，其檢測失敗率為11.1%，兩法檢測的靈敏度無顯著差異（χ2＝0.25，P＞0.05）。融合基因陽性患者中4例患者最終復發APL，因此在此階段PML－RARα融合基因檢測陽性而復發APL的預測值為44.4%。

表1 誘導緩解后PML－RARα融合基因檢測結果

2.2.2 鞏固及維持治療后PML－RARα融合基因的檢測 APL患者治療達CR，再經過連續3個月鞏固化療后，31例具有完整病歷資料APL患者的PML－RARα融合基因檢測結果見表2，27例融合基因陰性患者至今持續達到分子生物學緩解，無復發病例。4例PML－RARα融合基因陽性患者，2例FISH檢測示陰性（陽性檢測失敗率為50%）；1例RT－PCR檢測示陰性（陽性檢測失敗率為25%），3例患者最終復發APL，1例患者經治療后緩解，因此在此階段其融合基因陽性復發APL的預測值為75%。

表2 鞏固維持治療后PML－RARα融合基因檢測結果

3 討論

MRD是指白血病經過治療達到完全緩解（CR）后體內殘留白血病細胞的狀態，它是導致白血病復發的主要根源。因此，MRD的早期檢測是防止白血病復發和提高患者長期生存率的重要措施。MRD的檢測方法包括細胞形態學、免疫學、細胞遺傳學、聚合酶鏈反應（PCR）等。APL患者化療前白血病細胞總數＞1012，化療緩解后減少到108，形態學方法就難以檢出MRD，常規細胞遺傳學分析因分裂相數量和質量的限制，因此也不是檢測MRD的敏感方法。PML－RARα融合基因是APL特征性的分子遺傳學標志，對疾病的診斷、治療及預后評估具有非常重要的臨床價值。RT－PCR和FISH技術是臨床上非常有效的PML－RARα融合基因檢測技術，APL患者經ATRA和As2O3聯合治療后PML－RARα融合基因陰性的患者，僅有1例在誘導化療結束后該融合基因呈陰性的患者在2年內出現了復發，在此階段基因檢測陰性復發APL的預測值僅為4.3%，而PML－RARα陽性復發APL的預測值為44.4%；而經鞏固和維持治療后，融合基因陰性的患者尚未見復發病例，PML－RARα陽性而復發APL的幾率（75%）較誘導化療結束時高，因此，PML－RARα基因陰性提示非常低的APL復發概率，而陽性則預示著較高的復發風險。Joseph等［7］研究結果顯示PML－RARα融合基因檢測2次以上陰性患者者，僅7%的患者發生復發，而2次以上陽性者，100%復發。

RT－PCR和FISH技術在實際應用過程中都存在各自的局限性，在發生隱性易位（包括插入易位和復雜易位）的患者中，若不使用特異性位點探針，FISH檢測結果常為陰性［8］，本研究結果顯示在誘導緩解和鞏固維持治療后其陽性檢測失敗率分別為33.3%和50%。而在RT－PCR反應體系中，高質量的RNA及高效的逆轉錄是實驗成功的關鍵步驟［9］，若提取的RNA數量及質量達不到實驗要求則是引起實驗失敗的主要原因，在前后兩次檢測中RT－PCR的陽性檢測失敗率分別為11.1%和25%，因而比較而言，RT－PCR對APL患者MRD監測的靈敏度較FISH稍高，但無統計學意義（P＞0.05），而FISH相對要求的分析細胞數量較少，且無論是分裂間期還是分裂期細胞均可獲得準確結果，特異性高。因此，在實際臨床實踐中可使它們相互補充，可得到更全面準確的實驗結果。

綜上所述，RT－PCR和FISH技術是兩種重要的監測APL患者體內PML－RARα融合基因表達情況的技術方法，準確而及時的PML－RARα融合基因的檢測結果不僅對APL患者疾病的診斷具有重要價值，而且在APL患者微小殘留病灶的監測發揮重要作用，并指導臨床及時進行藥物干預治療，提高患者的長期生存率及改善患者生活質量。

［1］馬 軍.白血病［M］.北京：北京大學出版社，2007：24.

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［3］Park JH，Tallman MS.Treatment of acute promyelocytic leukemia without cytotoxic chemotherapy［J］.Oncology ，2011 ，25（8）：733.

［4］劉 元，沈志祥，陳 竺，等.全反式維 甲酸聯合三氧化二砷治療初發急性早幼粒細胞 白血病的近期療效觀察［J］.中華血液學雜志，2003，24（1），25.

［5］張之南.血液病診斷及療效標準［M］.北京：科學出版社，1998：279－280.

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［7］Jurcic JG，Nimer SD，Scheinberg DA，et al.Prognostic significance of minimal residual disease detection and PML／RAR－alpha isoform type：long－term follow－up in acute promyelocytic leukemia［J］.Blood，2001，98（9）：2651.

［8］Choughule A，Polampalli S，Amre P，et al.Identification of PML／RARa fusion gene transcripts that showed no t（15；17）with conventional karyotyping and fluorescent in situ hybridization［J］.Genet Mol Res，2009，8：1.

［9］Grimwade D，Biondi A，Mozziconacci MJ，et al.Characterization of acute promyelocytic leukemia cases lacking the classic t（15；17）：results of the European Working Party.Groupe Francais de Cytogenetique Hematologique，Groupe de Francais d＇Hematologie Cellulaire，UK Cancer Cytogenetics Group and BIOMED 1European Community－Concerted Action“Molecular Cytogenetic Diagnosis in Haematological Malignancies”［J］.Blood，2000，96：1297.