大鼠腎移植蛋白質組學雙向電泳技術體系的建立

呂天羽，王 康，劉建軍，何建凡，李德萍，唐 敏，王玉新，戴 勇＊

（1.廈門市第二醫院，福建 廈門361021；2.深圳市人民醫院，暨南大學第二臨床醫學院，廣東 深圳518020；3.深圳市疾病預防控制中心，廣東 深圳518020；4.重慶醫科大學，重慶400016）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物模型 雄性近交系lewis（RT11）大鼠6只，F344（RT11v1）大鼠6只，（均購自北京維通利華實驗動物有限公司）體重260－280g。隨機分組，F344大鼠為供體lewis大鼠為受體，獲得同種異基因移植模型［1］。術后不給予免疫抑制劑干預治療。術后3d動物仍存活則認為大鼠腎移植急性排斥反應動物模型建模成功。

1.1.2 標本收集 術后3d、7d取出移植腎，每個時間點樣本為3只。標本一部分行HE染色病理學檢查；另一部分液氮保存，待用。

1.1.3 試劑 固相pH梯度干膠條（pH4－7，13cm；pH3－11，13cm）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、TEMED、2Dclean－up kit、2DQuant Kit 購 于 Amersham Pharmacia Biotech公司；甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、過硫酸胺、硝酸銀、碳酸鈉、甘油、甘氨酸購于BBI公司；丙酮購于Sigma公司；蛋白酶抑制劑（Complete Mini，EDTA－free）購于 Roche公司，其他試劑為國產分析純試劑。

1.1.4 主要儀器 IPGphor等電聚焦儀、SHE600垂直電泳儀、高精度掃描儀、ImageMaster 2D5.0凝膠分析軟件為安瑪西亞公司（Amersham Pharmacia Biosciences）公司產品。

1.2 方法

1.2.1 溶液成分 樣品裂解液、IPG溶脹液、平衡液、銀染溶液均參照郭堯君［2］著《蛋白質電泳實驗技術》配制。

1.2.2 腎臟雙向凝膠電泳 ①腎臟組織蛋白的制備取液氮中大鼠移植腎，室溫解凍，研磨成細粉末狀。按組織凈重：裂解液＝1∶10比例其中加入蛋白酶抑制劑混合制劑 Complete Mini，EDTA－free，1片／10ml。冰上繼續研磨。收集液體，4℃12 000×g 60分鐘后收集上清液。再經以下處理（1）組織蛋白樣品純化（2）樣品蛋白濃度測定。所得樣品－80℃冰箱保存，備用。②雙向凝膠電泳 按IPGphor TM等電聚焦系統指南進行雙向電泳。③染色 銀染色和考馬斯亮藍染色都是采用郭堯君［3］的染色方法并作適當改動。

1.2.3 2DE圖像采集與分析

染色的凝膠經透射掃描用ImageMaster2D5.0軟件分析，不同膠匹配點相對含量的比值＞2或者＜0.5認為存在差異。

2 結果

2.1 病理學結果

大鼠腎移植后7d可以看到腎小動脈周淋巴細胞浸潤，結締組織增生，腎小動脈外膜結締組織增生，淋巴細胞浸潤。

2.2 雙向電泳凝膠結果

從四種不同角度對腎臟組織進行蛋白質圖譜分析，分析結果如表1。

表1 雙向凝膠電泳檢測結果

3 討論

腎移植急性排斥反應是排斥反應中最常見的一種類型。但是到目前為止，對于早期診斷腎移植急性排斥反應的發生仍沒有可靠的依據。應用新的研究技術進一步探索其早期診斷的特征性標記物，成為了各國研究人員關注的焦點。雙向電泳技術作為蛋白質組學研究的經典方法，它當然成為了現今研究的熱點。因此建立一個專門針對腎臟組織成分變化的方案才能更好地應用蛋白質組技術開展腎移植排斥反應的研究。本研究以大鼠腎臟組織蛋白為樣品，對樣品制備、等電聚焦（IEF）上樣量、凝膠染色等進行比較和條件的優化，獲得滿意的大鼠腎臟組織蛋白2DE圖譜。

（1）本研究首先用13cm（pH3－11NL）的膠條進行IEF，發現組織蛋白廣泛分布于等電點（PI）3－11的范圍。大鼠腎移植同種異基因移植物檢測到（626±49）個蛋白點，平均匹配率為65.76%；經ImageMaster2D5.0凝膠軟件分析發現差異蛋白主要分布在PI4 5－7.0范圍處，為更清晰觀察和比較異基因移植物中差異性表達的蛋白分布情況，以下研究均采用13cm（pH4－7L）IPG膠條。

（2）組織樣品中的非蛋白雜質如鹽、外源帶電小分子、去污劑等多種小分子，這些物質會影響IEF，使電壓難以達到IEF所需，最終可能影響2DE的分離效果。本研究選用丙酮沉淀和2Dclean－upkit純化樣品，與處理前相比這兩種方法均能得到清晰的蛋白點。但丙酮處理會致血清PI5－6處蛋白丟失，影響該區域差異蛋白的比較，為確保差異表達的蛋白均能呈現出來本研究采用2Dclean－upkit來處理樣品。

（3）樣品蛋白含量測定的準確性會直接影響IEF上樣量的確定和2DE圖譜蛋白點呈現的多少。如果異基因移植物樣品的蛋白上樣量太低，在2DE圖譜染色呈現的蛋白點也很少，從而影響異基因移植物中蛋白質表達的比較。蛋白上樣量過大的話對蛋白點的分離效果就不好，較模糊。本研究采用的蛋白不同上樣量中，120μg蛋白能得到最佳的圖譜效果，有差異表達的蛋白點顯示較為清晰。但是這一上樣量不一定就是最合適的，在今后的實驗中仍需摸索。

（4）蛋白質被分離后，能否被有效檢測，染色方法起到很重要的作用。2DE的染色方法有許多種。考馬斯亮藍染色［4］雖特異性高，但是對上樣的劑量要求大，在相同上樣量的情況下，與經改良的銀染方案［5］相比較，其敏感性較差。最終以銀染色法的電泳圖譜更為滿意。

通過對以上幾種有可能影響組織蛋白質雙向電泳的各因素比較，本研究獲得了優化后的大鼠異基因移植物蛋白質圖譜衍變的研究方案，即：使用13 cmIPG膠條（pH4－7L）進行等電聚焦、2Dclean－upkit純化蛋白樣品、改良的銀染色法方案，為條件優化后的大鼠異基因移植物蛋白質2DE銀染圖譜。在相同條件下，分別對不同時間點的樣品進行3次雙向電泳實驗，掃描圖譜經ImageMaster2D5.0凝膠軟件分析和數據統計后顯示：移植后3d異基因移植物中檢測到（512±62）個蛋白點，平均匹配率為76 32%；移植后7d異基因移植物中檢測到（478±56）個蛋白點，平均匹配率為73.11%，提示本項研究采用的蛋白質雙向電泳技術方案有較好重復性，為今后異基因移植物研究提供了一個新的實驗體系。

［1］王 康，戴 勇，李德萍，等.大鼠原位腎移植模型腎靜脈吻合方法的改良［J］.中華器官移植雜志，2006，27（1）：54.

［2］郭堯君.雙向電泳.見：郭堯君.蛋白質電泳實驗技術［M］.第2版.北京：科學出版社，2005，203－207.

［3］郭堯君.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳.見：郭堯君.蛋白質電泳實驗技術［M］.第2版.北京：科學出版社，2005：106－108.

［4］Candiano G，Bruschi M，Musante L，et al.Blue silver：A very sensitive colloidal Coomassie G－250staining for proteome analysis［J］.Electrophoresis 2004，25（9）：1327.

［5］王劍青，戴 勇，鄧國安，等.尿毒癥患者血清蛋白質組份的雙向凝膠電泳－飛行時間串聯質譜分析研究［J］.中華腎臟病，2005，9（21），506.