小鼠骨髓及脾臟來源的樹突狀細胞培養及鑒定

孫國龍，王凱忠，周 莉，付 鑫，田曉巍，王登莉，趙 慧＊

（1.吉林大學第一醫院 胸外科，吉林 長春130021；2.吉林大學白求恩醫學院組織學與胚胎學教研室，吉林 長春130021）

樹突狀細胞（Dendritic Cell－DC）是由Steinman和Cohn［1］（1973）首次分離出來的，它是目前所知的機體內功能最強的抗原提呈細胞，也是唯一能將抗原提呈給初始T細胞，激發初次免疫應答的抗原提呈細胞。本研究從小鼠骨髓及脾臟中獲取DC的前體細胞，然后在細胞因子的作用下培養出DC，并對其進行鑒定以及比較這兩種不同組織來源細胞分化成DC的差異。

1 材料與方法

1.1 主要實驗儀器 三洋CO2培養箱、BD Bioscience流式細胞儀、奧林巴斯光學倒置顯微鏡。

1.2 實驗動物和試劑 ICR小鼠18只，雄性，體重20－25g，周齡8－10w，無菌環境飼養。由吉林大學動物實驗中心所提供。EZ－SepTMMouse淋巴細胞分離液購自達科為生物技術有限公司，IL－4、GMCSF、FITC－labeled Anti－Mouse CD80、PE－labeled Anti－Mouse CD86購自美國PEPROTECH公司。

1.3 細胞提取 ICR小鼠經脫頸椎處死后立即浸入體積分數為75%的乙醇中5－10min。無菌取出脾以及游離小鼠四肢帶有髓腔的骨骼。

脾臟的處理：去除脾臟外表面的脂肪被膜，以預冷至4℃pH 7.2的PBS沖洗2次，在35mm培養皿中放入4mL EZ－SepTMMouse淋巴細胞分離液。經充分研磨后把懸有脾臟細胞的分離液立即轉移到15mL離心管中，覆蓋200μl的1640培養基。室溫，800g離心30min。細胞層由上到下分4層，1640覆蓋層、淋巴細胞層、EZ－Sep分離液層、紅細胞及其他細胞和死細胞碎片。吸出淋巴細胞層，再加入10mL1640培養基，顛倒洗滌。室溫，250g，離心10min收集細胞。傾倒上清液，用無血清培養基重懸細胞，計數細胞。將細胞濃度調至5×106／ml，然后分瓶培養。

股骨的處理：無菌手術取出股骨、脛骨、肱骨，盡量將其表面的肌肉和結締組織去除干凈，然后放入無菌的PBS中，剪斷骨的兩端，用1ml無菌注射器抽取含青霉素鈉6U／ml，鏈霉素10U／ml的生理鹽水反復沖洗出骨髓，直至骨變白，收入15mL離心管中，1 500r／min，5min離心，棄上清，收集沉淀的骨髓細胞，置于含有雙抗、10%胎牛血清、終濃度為2mmol／L的谷氨酰胺的RPMI 1640培養液中培養。分裝于細胞培養瓶。置于37℃、5%的CO2培養箱中培養。

脾臟的淋巴細胞和骨髓細胞都靜置培養48小時后，傾去懸浮細胞，更換新的培養液，同時加入GMCSF（終濃度500ng／L）和IL－4（終濃度200ng／L）。

1.4 細胞生長狀態的觀察 在培養的第1、2、3、4、5、6、7天用光鏡觀察細胞的形態變化，照相。

1.5 流式細胞術檢測細胞表面的共刺激分子 收集的培養細胞用PBS懸浮為1×106細胞／ml，加入3個EP管中，300μl／管，在2個管里分別加入FITC－labeled Anti－Mouse CD80 和 PE－labeled Anti－Mouse CD86（終濃度為0.5mg／L），另1個EP管內的培養細胞不加入熒光標記抗體，將其作為空白對照組。混勻，置于37℃、5%的CO2培養箱中孵育45min。孵育結束后用PBS清洗2遍，1 500rpm離心3min，棄上清，各加300μL的PBS（pH＝7.4）懸浮，上流式細胞儀檢測。各組細胞3、5、7天行流式細胞儀檢測，觀察CD80、CD86表達隨培養細胞成熟的變化趨勢。

1.6 統計學分析 應用SPSS13.0軟件進行Fisher精確概率法檢驗，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 培養細胞的形態學觀察 見圖1。

圖1 The expression of cytokines of the bone marrow cells cultured with stimulating factor GM－CSF and IL－4at different time points（n＝6）

由小鼠骨髓直接分離的DC很少，經GM－CSF和IL－4誘導分化培養3天后DC量逐漸增多，細胞大量增殖，每2只小鼠的骨髓細胞可得到（2.0－5.0）×107個DC，完全能夠滿足實驗的要求。

骨髓細胞鏡下觀察：培養的第1天在光學顯微鏡下觀察：培養液中充滿了大量的骨髓原始細胞，大小不等，懸浮細胞數較多；第2天部分細胞邊緣開始出現少量不規則形態的突起，貼壁細胞數目增多；在第3天貼壁細胞數量明顯增加，部分細胞伸出很多像樹枝樣的突起，培養瓶中可見明顯細胞集落形成，細胞狀態長勢良好；第4天細胞數目明顯增加，培養液中出現漂浮的或松散聚結的典型DC，部分形成較大的細胞集落；第5天少量細胞懸浮起來；隨著培養時間的延長，第6天伸出突起的細胞出現突起回縮的狀態，大量細胞懸浮起來；第7天懸浮細胞大量增多，大量細胞出現衰老死亡現象。

脾臟淋巴細胞鏡下觀察：在培養的7天內光學顯微鏡下觀察培養液中未見貼壁的細胞，大量細胞呈懸浮狀態。

2.2 流式細胞術的檢測結果 見圖2～圖4。

本實驗檢測結果顯示：GM－CSF和IL－4誘導培養的骨髓細胞在第3天均可檢測到CD80、CD86，但是表達的百分率低，CD86基本不表達。在誘導培養的第5天，CD80表達的百分率是第3天的12倍，但是CD86表達的百分率與第3天表達相比無明顯變化。誘導培養第7天CD80表達的百分率是第5天的3倍，但是CD86表達仍很低，與第3天、第5天相似，無明顯變化。結果表明，CD80表達的百分率隨著細胞培養時間的延長，表達率呈遞增趨勢，統計學分析結果顯示各組間差異顯著，P＜0.01。而CD86表達的百分率一直呈低表達的現象。

3 討論

DC是目前為止發現的功能最強的專職抗原提呈細胞，它對誘導初次免疫應答具有獨特的功能。盡管其在體內數量甚少，但分布廣泛，遷徙力強，加之樹枝狀表面所賦與的巨大表面積，有利于接觸并提呈抗原，是提呈能力最強的抗原提呈細胞。未成熟的DC具有很強的吞噬、加工處理抗原的能力，它作為免疫耐受原在移植免疫應答中的重要地位。它是唯一能激活初始免疫應答的抗原提呈細胞［2－4］。在接受抗原刺激成熟后，DC可以有效地攝取抗原并通過抗原肽／MHC分子復合物的形式將抗原有效地提呈給初始T細胞，并刺激其生成針對該抗原的特異性的細胞毒性T細胞，從而有效地啟動機體的免疫反應［5］。

圖2 GM－CSF和IL－4誘導培養的骨髓細胞誘導第3天的細胞流式圖譜

圖3 GM－CSF和IL－4誘導培養的骨髓細胞誘導第5天的細胞流式圖譜

由于DC在體內含量極低，而且提取物中又會含有其他的細胞，因此DC的體外培養關鍵問題是DC的分離、提取以及誘導分化。本實驗用ICR小鼠做DC的來源，但它骨髓細胞含量極其少，通過培養增加數量，滿足實驗的要求。從股骨中提取骨髓細胞和脾臟中提取淋巴細胞，進行培養。在培養的過程中，通過細胞的貼壁特性，盡量除去粒細胞，以提高培養DC的純度。同時應加入刺激因子，使其向DC分化。在培養過程中，GM－CSF起到重要的作用，不僅誘導DC前體細胞增殖，而且還能促進DC的分化和延長DC的壽命，并使骨髓前體細胞形成集落，促進DC的增殖，若是單獨使用GM－CSF只能產生少量的DC集落。IL－4能抑制培養體系中的中性粒細胞、巨噬細胞的產生。GM－CSF與IL－4聯合應用，既能提高DC的產量，又能增加DC的純度。通過脾臟淋巴細胞和骨髓細胞分化成DC的結果觀察：骨髓細胞的前體細胞誘導分化成DC的數量多，易獲得，誘導時間短。而脾臟淋巴細胞誘導分化為DC，不僅難獲得，而且誘導周期長，獲得的DC數量也極其有限，不利于后續試驗的進行。

圖4 GM－CSF和IL－4誘導培養的骨髓細胞誘導第7天的細胞流式圖譜

本實驗的經驗總結如下：1）剛提取出來的骨髓細胞，在加入刺激因子之前最好不要頻繁地移動培養瓶，以便細胞能充分地貼壁，也防止貼壁的細胞懸浮起來，影響其貼壁的能力；2）選擇加入刺激因子的時間為提取細胞培養48小時后加入。原因就是細胞數量大部分已經充分貼壁，可增加誘導成DC的數目。3）對于誘導中采用的細胞的因子濃度，不同的文獻報道差異較大，并且誘導時間，處理方法都不完全相同。在本實驗中，我們采用終濃度為500 ng／L GM－CSF、200ng／L IL－4的細胞因子組合。誘導培養3d即可見到大量的具有典型樹突狀突起的細胞生成；4）脾臟來源的主要是淋巴細胞，脾臟的淋巴細胞數目雖多，但培養48小時后貼壁的細胞數目少，加刺激因子后細胞數目變化不大。培養7天后貼壁的細胞數目有所增加，由于誘導周期長，不利于進行后續試驗。與文獻報道的有很大的差異［6］。為了進行后續實驗只能采取骨髓來源來誘導DC；5）體外誘導骨髓細胞培養3d即可見到大量的具有典型樹突狀突起的細胞生成。隨著時間的推移，細胞數目大量的增加，但是通過多次實驗的經驗，在培養到第7天，細胞就開始出現懸浮狀態，并且隨著時間的延長，懸浮的細胞數目大量增加，大量細胞出現衰老死亡現象。不利于后續實驗的實施。前7天的骨髓細胞處于未成熟期，如果加入LPS（磷酸脂多糖）則可誘導成為成熟的DC。根據細胞的狀態，培養到3－5d的細胞可利于后續試驗的進行。本實驗的目的是獲得未成熟的DC。后續試驗利用其具有強大的專職抗原提呈細胞的功能以及它對誘導初次免疫應答獨特的功能，再與后續分選的CD4＋CD25＋Treg細胞結合對抗移植器官的排斥反應。

［1］Steinman RM，Cohn ZA.Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs ofmice.I.Morphology，quantitation tissue distribution［J］.J Exp Med，1993，137（5）：1142.

［2］Gil－Torregrosa BC，Lennon－Duménil AM，Kessler B，et al.Control of cross－presentation during dendritic cell maturation［J］.Eur J Immunol，2004，34（2）：398.

［3］Pulendran B.Variegation of the immune response with dendritic cells and pathogen recognition receptors［J］.J Immunol，2005，174（5）：2457.

［4］Zeng Z，Liu X，Jiang Y，et al.Biophysical studies on the differentiation of human CD14＋monocytes into dendritic cells［J］.Cell Biochem Biophys，2006，45（1）：19.

［5］Chauvin C，Josien R.Dendritic cells as killers：mechanistic aspects and potential roles［J］.J Immunol，2008，181（1）：11.

［6］李宗輝，黃軍華，劉 俊.小鼠脾臟來源樹突狀細胞的體外擴增培養［J］.疑難病雜志，2009，8（9）：520.