胃旁路術(shù)對(duì)非肥胖2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞凋亡的影響

鞠振煜，張明威，曲日初，朱寶平，張 偉，田曉豐

（吉林大學(xué)普通外科疾病診療中心、吉林大學(xué)第二醫(yī)院普通外科，吉林 長(zhǎng)春130041）

20世紀(jì)80年代減肥醫(yī)師發(fā)現(xiàn)用于減重手術(shù)的胃旁路手術(shù)（Gastric bypass，GBP）可以使伴Ⅱ型糖尿病的肥胖患者在減重的同時(shí)，可以使糖尿病癥狀完全緩解。近年來(lái)，胃腸道重建的GBP手術(shù)治療2型糖尿病的研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在建立自發(fā)性2型糖尿病大鼠GBP手術(shù)模型，探索GBP術(shù)對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的影響，為GBP術(shù)治療非肥胖2型糖尿病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)用8周齡GK大鼠由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物自由攝取凈水，食物為添加高蛋白的含油脂飼料。大鼠在適應(yīng)環(huán)境后，測(cè)量體重、空腹、餐后血糖，胰島素。72只大鼠隨機(jī)分為4組：手術(shù)組（O組）、假手術(shù)組（S組）、飲食控制組（F組）和對(duì)照組（C組）。原裝進(jìn)口凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司。強(qiáng)生穩(wěn)步血糖測(cè)定儀。

1.2 模型制作

O組術(shù)前將大鼠禁食12h，將每只大鼠按照50 mg／kg腹腔內(nèi)注射濃度為0.5%的戊巴比妥鈉，待麻藥生效后，與上腹正中作長(zhǎng)約4cm的切口，切斷幽門(mén)，縫合十二指腸殘端，在距treitz韌帶約10cm處切斷空腸，幽門(mén)斷端與遠(yuǎn)端空腸行端端吻合，在距離胃腸吻合口約12cm處行空腸端側(cè)吻合，均采用0／7號(hào)無(wú)創(chuàng)傷棉綸線(xiàn)間斷縫合，縫合系膜裂孔。術(shù)中保留了胃的原容積，平均手術(shù)時(shí)間為1h。S組：用上述同樣方法對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，采取離斷胃竇十二指腸后再原位吻合，并保證相同的麻醉時(shí)間。術(shù)終均用慶大霉素（96萬(wàn)U）2ml沖洗腹腔后關(guān)腹，術(shù)后麻醉醒后自由進(jìn)水，24h后自由進(jìn)食。F組，控制每只大鼠進(jìn)食量15g／d，保證充足飲水。O、F、C組均自由進(jìn)食，保證充足飲水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

術(shù)前、術(shù)后第1、2、4、8周5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，大鼠禁食過(guò)夜，剪尾法取血0.5ml后，灌服葡萄糖（2.5g／kg），30min后再取血0.7ml，血樣分別立即加入裝有DPPIV inhibitor10μL的試管中，混勻，靜置30 min后4 000rpm離心10min，分離血清，用于測(cè)定血糖、胰島素。術(shù)后2w、4w、8w測(cè)餐后血糖取血后，分批隨機(jī)處死大鼠，每批每組處死6只，大鼠處死后分離胰腺并取出。濾紙吸干水份后沿胰腺縱軸切開(kāi)，一部分置于10%多聚甲醛中固定待用。血糖測(cè)定：取血后使用強(qiáng)生穩(wěn)步血糖儀測(cè)定血糖。胰島素測(cè)定：采用放射免疫法測(cè)定，雙管法，取兩次測(cè)定的平均值。TUNEL法檢測(cè)胰島β細(xì)胞凋亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同組之間的同一時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，單個(gè)指標(biāo)手術(shù)前后的變化采用配對(duì)t檢驗(yàn)，采用SPSS13.0for Windows統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 血糖

O組GΒP術(shù)后第1周空腹血糖已開(kāi)始下降，術(shù)后第4周空腹血糖由術(shù)前的16.21±0.76mmol／L下降到9.18±0.61mmol／L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；至術(shù)后第8周血糖維持在9.65±0.66 mmol／L，與術(shù)前、術(shù)后2周比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。術(shù)后第4周餐后血糖由術(shù)前的31.06±1.10mmol／L下降到13.11±0.71mmol／L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；至術(shù)后第8周下降到12.32±0.66mmol／L，與術(shù)前、術(shù)后2周比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；O組術(shù)后第4、8周空腹、餐后血糖與同時(shí)間其他各組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；F組在控制飲食1周后空腹血糖也出現(xiàn)下降，第4周、第8周由15.84±114mmol／L 分別下降到11.65±0.63mmol／L、12.00±0.58mmol／L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；S組、C組實(shí)驗(yàn)過(guò)程中后空腹血糖無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

2.2 胰島素

O組術(shù)后第4周起空腹血清胰島素水平由術(shù)前27.95±1.16mIU／L升高到62.82±1.87mIU／L，術(shù)后第8周為61.64±1.35mIU／L，與本組術(shù)前、術(shù)后2周比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；均明顯高于相同時(shí)間點(diǎn)的其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；O組術(shù)后第4、8周餐后血清胰島素水平分別為77.43±1.05mIU／L、77.07±0.96 mIU／L，與本組術(shù)前、術(shù)后2周比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；明顯高于相同時(shí)間的其他各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0l）；F組、S組、C組實(shí)驗(yàn)過(guò)程中空腹及餐后血清胰島素水平無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

2.3 胰島β細(xì)胞凋亡水平改變

O組大鼠胰島隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸減少，至術(shù)后4周下降至5.92±0.74%，至術(shù)后8周凋亡細(xì)胞百分比為6.33±1.08%，細(xì)胞凋亡率明顯低于同時(shí)間其他各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與術(shù)后2周比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；O組術(shù)后第8周細(xì)胞凋亡率略高于第4周，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3、圖9－16）。

表1 各組大鼠血糖變化（mmol／L，±s）

表1 各組大鼠血糖變化（mmol／L，±s）

△ ：與同時(shí)間其他各組比較，P＜0.01；★：與同組術(shù)前，術(shù)后1、2W 比較，P＜0.01

組別 術(shù)前 術(shù)后1周 術(shù)后2周 術(shù)后4周 術(shù)后8周O組空腹 16.21±0.76 14.08±0.65△ 13.09±0.61△ 9.18±0.61△★ 9.65±0.66△★餐后 31.06±1.10 29.25±1.19△ 26.48±0.76△ 13.11±0.71△★ 12.32±0.66△★S組空腹 15.88±1.03 16.10±1.01 15.56±0.86 16.13±0.62 16.35±0.60餐后 31.32±1.44 30.39±1.56 31.35±1.27 31.03±0.93 31.66±1.17 F組空腹 15.84±1.14 15.53±0.92 13.11±0.66 11.65±0.63 12.00±0.58餐后 30.20±1.31 29.48±1.04 26.78±0.82 24.55±0.74 23.38±0.69 C組空腹 15.82±0.84 15.93±0.78 15.79±0.76 15.99±0.74 16.29±0.60餐后 30.93±1.35 30.19±1.42 30.81±0.78 31.07±1.13 30.96±0.85

表2 各組大鼠血清胰島素濃度變化（mIU／L，±s）

表2 各組大鼠血清胰島素濃度變化（mIU／L，±s）

△：與同時(shí)間其他各組比較，P＜0.01；★：與同組術(shù)前、術(shù)后1、2W 比較，P＜0.01。

組別 術(shù)前 術(shù)后1周 術(shù)后2周 術(shù)后4周 術(shù)后8周O組空腹 27.95±1.16 29.09±0.96△ 31.33±1.08△ 62.82±1.87△★ 61.64±1.35△★餐后 31.41±0.75 32.60±0.72△ 34.74±0.93△ 77.43±1.05△★ 77.07±0.96△★S組空腹 27.52±1.12 27.46±1.06 27.08±0.78 26.85±0.77 26.85±1.01餐后 31.49±0.90 32.13±0.88 31.26±0.86 31.19±1.21 31.26±1.19 F組空 腹 27.90±1.23 27.30±1.06 28.72±1.02 30.72±1.09 30.17±0.88餐后 31.37±0.79 32.38±0.75 32.60±0.70 33.63±0.86 33.22±0.73 C 組空腹 27.44±1.23 27.40±0.83 26.96±0.81 26.77±0.83 26.57±0.96餐后 31.05±0.79 31.24±0.92 30.64±0.95 30.71±1.24 30.40±1.53

表3 術(shù)后各組大鼠胰島凋亡細(xì)胞數(shù)及凋亡細(xì)胞百分比（%，±s）

表3 術(shù)后各組大鼠胰島凋亡細(xì)胞數(shù)及凋亡細(xì)胞百分比（%，±s）

△ ：與同時(shí)間其他各組相比P＜0.01；★：與術(shù)后2W相比，P＜0.01

組別 術(shù)后2w 術(shù)后4w 術(shù)后8w凋亡細(xì)胞數(shù) 百分比O組 18.67±2.25△ 9.33±1.13△ 11.83±1.47△★ 5.92±0.74△★ 12.67±2.16△★ 6.33±1.08凋亡細(xì)胞數(shù) 百分比 凋亡細(xì)胞數(shù) 百分比△★S組 93.33±1.86 46.67±0.93 94.33±1.97 47.17±0.98 94.33±2.07 47.17±1.03 F 組 48.67±2.58 24.33±1.29 42.17±2.32 21.08±1.16 42.33±2.42 21.17±1.21 C 組 92.50±2.88 46.25±1.44 93.00±3.29 46.50±1.44 92.00±2.83 46.00±1.41

3 討論

GBP術(shù)后第4、8周空腹及餐后血糖明顯下降，表明GBP對(duì)非肥胖2型糖尿病大鼠的糖代謝具有良好的改善作用。GBP對(duì)2型糖尿病大鼠的糖代謝改善作用的機(jī)制可能與減少胰島素抵抗和改善胰島功能有關(guān)［1］。本研究顯示，GBP術(shù)后第4、8周空腹及餐后 胰島素水平 升高。表明GBP手術(shù)可改善胰島β細(xì)胞功能，在治療2型糖尿病中起著重要的作用。

20世紀(jì)80年代便有資料表明2型糖尿病患者胰島β細(xì)胞的數(shù)量明顯下降［4］。事實(shí)上，最近一些通過(guò)研究手術(shù)后的胰腺標(biāo)本證實(shí)在2型糖尿病發(fā)病機(jī)制中，胰島β細(xì)胞數(shù)量的減少和功能的下降起到了重要的作用［2，3］。英國(guó)前瞻性糖尿病研究（UKPDS）顯示，2型糖尿病患者無(wú)論是否接受強(qiáng)化治療，隨著病程的延長(zhǎng)，最終將因胰島β細(xì)胞功能受損導(dǎo)致血糖控制上的惡化。引起胰島細(xì)胞功能障礙的原因比較復(fù)雜，細(xì)胞凋亡是2型糖尿病胰島β細(xì)胞數(shù)量減少的主要原因，凋亡引起的胰島β細(xì)胞數(shù)量減少足以致高血糖。從上世紀(jì)90年代至今的十幾年間，大量的動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)和人體尸檢研究顯示胰島β細(xì)胞的高水平凋亡在糖尿病發(fā)生前就已存在，糖尿病發(fā)生后，凋亡水平進(jìn)一步增高。胰島β細(xì)胞的凋亡可能是導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要因素，這些細(xì)胞的衰竭最終導(dǎo)致機(jī)體血糖的升高和2型糖尿病的發(fā)生［5］。凋亡的增多或減少都會(huì)導(dǎo)致特定疾病的病理生理過(guò)程，尤其是細(xì)胞凋亡增多，是導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少和功能下降的重要原因。在2型糖尿病，有多種因素可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致胰島功能受損。文獻(xiàn)報(bào)道，成年高血糖GK大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量下降達(dá)60%［6］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)GBP術(shù)干預(yù)的糖尿病鼠的胰島β細(xì)胞凋亡水平在術(shù)后2、4、8W均顯著低于對(duì)照組，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），從而證實(shí)GBP術(shù)的確能夠有效降低胰島β細(xì)胞凋亡水平。GBP術(shù)對(duì)糖尿病的控制作用，可能就與其抑制β細(xì)胞凋亡，從而有效地保護(hù)胰島細(xì)胞功能和延緩胰島細(xì)胞功能障礙進(jìn)展有關(guān)。

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