漢防己甲素對肝癌耐藥細胞抑制作用機制研究

孫倩茹，王炳芳，張明，王慶華

(1.江蘇大學臨床醫學院，江蘇鎮江212013;2.江蘇大學附屬昆山醫院消化科，江蘇昆山215300)

肝癌是惡性腫瘤中發病率和惡性程度較高的一種，因其早期診斷比較困難，晚期的手術存活率低且復發率高，嚴重危害人類的健康。采用化療多因肝癌的天然性和(或)獲得性耐藥，致使抗癌藥的細胞毒性降低，即使增加劑量，又因其嚴重的不良反應而被迫中斷治療。

近來有漢防己甲素(tetrandrine，TET)抑制癌細胞增殖的報道［1－3］，但在其作用機制方面的研究中只提出了與P-170糖蛋白競爭性抑制有關。本文通過研究TET對細胞內Ca2+濃度影響及其與腫瘤細胞的DNA合成、腫瘤細胞內抗癌藥濃度等之間的關系，探討TET及其聯合抗癌藥抑制肝癌耐藥細胞系增殖的機制，以尋找藥物抗癌的新途徑，為新型抗癌藥物的研制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌耐藥細胞系(BEL-7402/DOX)由本研究室誘導［4］;TET(浙江金華制藥廠);多柔比星(doxorubicin，DOX)，Fura-2/AM，四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Sigma公司;Triton X-100由美國進口，上海化學試劑公司分裝廠分裝。

1.2 方法

1.2.1 TET及其聯合DOX對BEL-7402/DOX抑制率的測定 選擇對數生長期BEL-7402/DOX細胞，經胰酶消化后，以含10%小牛血清的RPMI-1640培養液調整細胞濃度為2×104/ml，分別加入48孔細胞培養板中，每孔1.0 ml細胞懸液。置37℃、5%CO2培養箱中孵育24 h后，將其分為5組:單獨DOX組(1.0 mg/L)，單獨 TET 組(2.5 mg/L)，兩種濃度的 TET(2.5 mg/L、5.0 mg/L)加 DOX 組(1.0 mg/L)，對照組加入等量的藥物溶劑。每個濃度做3個復孔，并分別加入MTT溶液20 μl(5.0 g/L)，繼續培養4 h后終止培養，吸去孔內培養液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀D(490 nm)處測量各孔的D值。抑制率=(對照組D值-藥物組D值)/對照組D值×100%。

1.2.2 癌細胞內抗癌藥物DOX濃度的測定 收集對數生長的BEL-7402/DOX細胞，以5×105/ml密度，每管加入2 ml(培養液稀釋)，同時加入5 mg/L的DOX，在此基礎上加入各種不同濃度的TET，每組3個復管，放入37℃的CO2孵育箱中培養1 h，用冷PBS 2 ml終止細胞代謝，1 000 r/min離心5 min，棄上清，細胞重復用冷PBS洗2遍，然后用PBS重新懸浮。將細胞在超聲波破碎儀上破碎1 min。破碎后正丁醇萃取，然后加 1.0 ml 0.9%NaCl，0.5 ml 30%三氯乙酸，振蕩混勻，4 000 r/min離心30 min，上清液在熒光分光光度計(475 nm/590 nm、狹縫各15 nm)上測定D值。

細胞內藥物濃度的計算:在測定D值時，設一標準對照管(本實驗對照管為2 ml雙蒸水中加5 μg DOX)。

1.2.3 細胞內Ca2+濃度的測定 選擇對數生長期BEL-7402/DOX細胞，經0.25%胰酶消化后收集細胞懸液，10 000 r/min離心5 min。沉淀的細胞用PBS液懸浮，并調整細胞濃度為1×1010/L。用臺盼藍染色判斷細胞活性(＞95%)。加入Fura-2/AM(終濃度為 10 μmol/L)，37℃ 避光孵育 50 min。10 000 r/min離心5 min。棄去上清液，用PBS液洗滌2次以除去殘留在細胞外的Fura-2/AM。最后加入等量的PBS液懸浮細胞，在RF-540島津熒光分光光度計上測定。為觀察Fura-2負載情況，將發射波長(Em)固定在510 nm，Em光柵10 nm，掃描激發波長(Ex)波峰，掃描范圍300～420 nm，掃描速度32 mm/min。熒光測定條件:Ex 340 nm，Em 510 nm，Em光柵10 nm，Ex光柵10 nm。根據公式［Ca2+］=Kd·(F－Fmin)/(Fmax－F)計算。Kd:Fura-2與Ca2+的解離常數，等于224 nmol/L;F:實際測得的熒光強度;Fmax:最大熒光值;Fmin:最小熒光值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 TET及其聯合DOX對BEL-7402/DOX的抑制作用

結果顯示，單用DOX和TET對肝癌耐藥細胞BEL-7402/DOX的抑制作用較弱;DOX與對細胞增殖基本無影響的2.5 mg/L濃度的TET合用時，其抑制率較單獨用DOX時明顯升高(P＜0.05);而與5.0 mg/L的TET合用時，其抑制率較單獨用DOX時升高更為顯著(P＜0.01)。結果表明，TET能協同化療藥物DOX的細胞毒性，且呈劑量依賴性，見表1。

表1 單獨用TET、DOX以及DOX與TET合用時對BEL-7402/DOX的抑制作用Tab 1 The inhibitory effect of BEL-7402/DOX cells treated with TET，DOX and TET plus DOX

2.2 TET對癌細胞內抗癌藥物DOX濃度的影響

濃度分別為 2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L 的TET分別與DOX共同加入BEL-7402/DOX及BEL/7402細胞中進行孵育。結果顯示，濃度為2.5 mg/L的TET可明顯增加肝癌耐藥細胞內DOX的濃度(P ＜0.05)，而當 TET 濃度為 5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L時，其增加肝癌耐藥細胞內DOX濃度的作用更為顯著，P均＜0.01。說明TET可抑制抗癌藥物的外排。

2.3 TET對BEL-7402/DOX細胞內Ca2+濃度的影響

在細胞外液不含Ca2+(Hanks液除去CaCl2并加入0.1 mmol/L的EGTA)時的胞內Ca2+濃度為(76±4)nmol/L，而當細胞外液為含Ca2+的Hanks液時，測得其濃度為(261±46)nmol/L。在含有Ca2+的Hanks液的細胞中，加入不同濃度的TET處理，結果顯示，TET濃度為2.5 mg/L時，其濃度無明顯變化(P ＞0.05)，TET濃度為5.0 mg/L時可顯著降低癌細胞內的Ca2+濃度(P＜0.05)，而當TET濃度為10.0 mg/L時，其降低癌細胞內Ca2+的作用更為顯著(P＜0.01)，呈劑量依賴性。

3 討論

腫瘤多藥耐藥(MDR)是腫瘤化療失敗的主要原因之一，尋找低毒高效的腫瘤耐藥逆轉劑已成為腫瘤化療藥物領域研究的熱點，目前進入臨床研究及應用的化學藥物逆轉劑因作用機制單一、選擇性差、中毒劑量與有效劑量接近等諸多原因，其廣泛臨床應用受到限制［5］。中藥因其資源分布廣泛、價格相對低廉、毒副反應小等優點，一些學者已經把逆轉肝癌多藥耐藥轉向了中藥的研究，中藥在腫瘤治療中具有廣闊的應用前景［6－8］。

漢防己甲素(TET)又名粉防己堿，是存在于防己科植物粉防己根中的雙芐基異喹啉衍生物，與尼卡地平相似，是一種非選擇性的鈣通道拮抗劑。研究發現，尼卡地平等鈣通道拮抗劑能導致耐藥細胞內化療藥物的積聚，其機制是逆轉劑能與細胞表面P-gp結合，導致其功能失活［9］。本研究結果顯示，TET對BEL-7402/DOX細胞內的Ca2+濃度有明顯的影響，能顯著降低細胞內的Ca2+濃度，且呈劑量依賴性，說明用TET可替代尼卡地平，通過鈣通道拮抗作用而抑制腫瘤細胞的增殖。胞內Ca2+作為細胞傳遞中的重要信使物質，在某些細胞的增殖中發揮著重要作用。TET作為胞內鈣拮抗劑可通過抑制胞內存貯Ca2+釋放，阻抑與鈣有關的受體活性，使胞內的Ca2+濃度降低。由于降低了胞內Ca2+濃度，因而削弱了肌醇酯激酶的活性，故可抑制細胞特別是腫瘤細胞的增殖。

20世紀70、80年代，已有國內外相關報道顯示TET在體外對大鼠腹水型肝癌細胞、人肝癌細胞、Hela細胞等多種細胞具有生長抑制作用。本文實驗結果表明，TET對細胞的增殖具有抑制作用。實驗應用2.5 mg/L的TET與DOX合用，結果顯示其抑制率較單獨用DOX明顯提高，增加TET的劑量(5.0 mg/L)，對細胞的增殖抑制率提高更加明顯，進一步說明TET對耐藥肝癌細胞有直接的細胞毒作用，并能顯著增強抗癌藥物的細胞毒作用，在一定程度上逆轉耐藥肝癌細胞的耐藥性。

1976年Juliano等［10］首先觀察到具有MDR表型的CHO細胞藥物積聚發生障礙，相對分子質量為170 000的膜糖蛋白—P-170糖蛋白過度表達。MDR細胞抗藥程度及胞內藥物積聚與P-170糖蛋白過度表達有關。目前已有相關研究顯示TET逆轉腫瘤細胞MDR的機制可能包括逆轉P-170糖蛋白的過度表達、逆轉谷胱甘肽S轉移酶的催化解毒功能、抑制多藥耐藥相關蛋白的表達等方面［11］。

根據既往的文獻報道及我們的研究結果，TET的抗腫瘤細胞MDR作用方面已取得一定的研究成果，對未來臨床有一定的應用前景，但是目前許多研究仍然局限于體外細胞實驗階段，大樣本的系統臨床研究報道還十分缺乏，其具體藥理、藥代動力學、藥效學、更為詳盡的逆轉腫瘤MDR的機制還需要更深層次的探索與研究。

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