不同發育階段恒牙牙髓組織中VEGF及受體的表達

關為群，王清妹

(福建醫科大學附屬協和醫院口腔科，福建福州350001)

在牙髓再生組織工程中，誘導血管再生是牙髓再生的關鍵。目前，誘導血管生成作用的因子有血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，堿性成纖維細胞生長因子，血小板源性生長因子，轉化生長因子α、β，腫瘤壞死因子，其中VEGF是血管生成最強有效的誘導者［1］。VEGF是一種高度特異的血管內皮細胞有絲分裂素，它與體內血管的形成及其滲透性的調節密切相關，VEGF生物學功能的發揮歸功于其對VEGF受體的識別，其中VEGFR-1/Flt-1介導血管內皮基底細胞滲透性的調節，VEGFR-2/Flk-1介導血管內皮細胞的增殖分化及滲透性的調節，VEGFR-3介導淋巴管的形成［2-3］。人牙髓組織中也存在少量 VEGF［4］，但在人恒牙不同發育階段牙髓組織VEGF的表達是否存在差異，且牙齒發育不同階段VEGF發揮效用是否也是通過識別不同的受體Flt-1或Flk-1而實現，這是牙髓生理學中值得關注的問題。本實驗的目的是通過組織和分子水平了解VEGF、Flt-1、Flk-1在人年輕恒牙和成熟恒牙牙髓組織的表達，為下一步應用組織工程將VEGF及其受體作為干預因子導入不同發育階段牙髓組織內，治療牙髓疾病提供新的思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對象為福建醫科大學附屬協和醫院口腔科門診就診患者，取因正畸治療需要而拔除的健康前磨牙，參照文獻［5］恒牙牙根發育的階段劃分法，結合X線片及患者年齡，將受試牙分為根尖孔開放的年輕恒牙和根尖孔閉合的成熟恒牙各15例，所有牙體均無齲病，無畸形中央尖，牙周組織健康，患者無系統性疾病，研究獲得患者本人或家屬的知情同意。年輕恒牙組年齡為10～14歲，成熟恒牙組年齡20～25歲，男女均有。

1.2 免疫組化染色

1.2.1 標本制備 按牙體脫鈣法進行標本制備［6］，經常規標本脫水石蠟包埋(圖1)，每個標本于牙髓長軸最大體積處連續切片，厚約5 μm，取5張分別用于 HE染色，VEGF、Flt-1、Flk-1免疫組化染色及陰性對照。

圖1 不同發育階段恒牙牙根Fig 1 The root of different developmental phase of permanent teeth

1.2.2 免疫組化染色 采用常規SP法，DAB顯色，以PBS代替一抗作為陰性對照，口腔牙周組織陽性染色片作為陽性對照。兔抗人Flt-1，Flk-1多克隆抗體(福州邁新生物技術公司)和兔抗人VEGF單克隆抗體(北京中杉試劑公司)的工作濃度均為1∶100。

1.2.3 圖像分析 鏡下(×400)每張切片隨機選取5個視野，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對陽性染色部位的平均光密度(D)值進行定量分析，以同張切片的空白區進行校正。5個視野的均值為該樣本的最終D值。染色強度與D值大小成正比。

1.3 實時熒光定量逆轉錄聚合酶反應(RT-PCR)

1.3.1 RT-PCR 標本制備 參照 Tjaderhane等［7］的方法，將新鮮的離體牙置于無菌Hanks液保存，距釉牙骨質界根方3 mm將冠根分開，置于無菌Hanks液中，用鑷子和探針小心取出牙髓，用無菌小挖匙刮下髓腔壁的成牙本質細胞，將取出的牙髓組織和成牙本質細胞置于加入少量Trizol離心管中，以防止組織RNA降解，收集好的標本-80℃冰箱中保存待檢。

1.3.2 RT-PCR反應 提取牙髓組織總RNA，測定純度定量后按照Qiagen公司逆轉錄試劑進行逆轉錄。PCR反應引物由上海康成生物工程公司合成。內參照GAPDH(299 bp)F:5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，R:5'-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3';VEGF(145 bp)F:5'-AGGGAAGAGGAGGAGATGAG-3'，R:5'-GCTGGGTTTGTCGGTGTT-3';Flt-1(169 bp)F:5'-GCAACAAGCCCGTTAGCC-3'，R:5'-CCCACATGGTGCGTCTCA-3';Flk-1(162 bp)F:5'-CCAATAATCAGAGTGGCAGTG-3'，R:5'-CATAGACATAAATGACCGAGGC-3'。反應體系:10 ×PCR緩沖液 2.5 μl，dNTP 2.5 μl，Taq 聚合酶 1 U，10 μmol/L 的 PCR 特異引物 F 1 μl，10 μmol/L 的 PCR特異引物 R 1 μl，cDNA1 μl，ddH2O 30 μl。反應條件為 GAPDH:95℃，5 min;35個PCR循環(95℃，10 s;59℃，15 s;72℃，20 s;83℃收集熒光，5 s)，擴增反應結束后繼續從72℃緩慢加熱到99℃(每5 s升高1℃)建立 PCR產物的熔解曲線。VEGF:95℃，5 min;35 個 PCR 循環(95℃，10 s;59℃，15 s;72℃，20 s;84℃收集熒光，5 s)，擴增反應結束后繼續從72℃緩慢加熱到99℃(每5 s升高1℃)建立PCR產物的熔解曲線。Flt-1:95℃，5 min;35個 PCR循環(95℃，10 s;59℃，15 s;72℃，20 s;83℃收集熒光，5 s)，擴增反應結束后繼續從72℃緩慢加熱到99℃(每5 s升高1℃)建立PCR產物的熔解曲線。Flk-1:95℃，5 min;35 個 PCR 循環(95℃，10 s;59℃，15 s;72℃，20 s;81.5℃收集熒光，5 s)，擴增反應結束后繼續從72℃緩慢加熱到99℃(每5 s升高1℃)建立PCR產物的熔解曲線。在指數增長期，得到的產物才和循環數有線性的關系，可進行半定量RTPCR分析。PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 統計分析

采用SPSS17.0統計軟件對測定結果進行分析，實驗數據以均數±標準差(±s)表示，應用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 牙髓組織VEGF、Flt-1、Flk-1免疫組化染色

VEGF表達于細胞的胞質或胞膜上，在牙髓血管內皮細胞、成牙本質細胞、成纖維細胞和基質細胞中都有表達。其中血管內皮細胞呈條索狀強陽性染色，其他細胞中呈絮狀、線狀或顆粒狀表達。Flt-1，Flk-1主要表達于血管內皮細胞胞質中。牙髓中Flt-1，Flk-1的表達均弱于VEGF(圖2)。

圖2 不同發育階段恒牙牙髓VEGF及受體的組織學表達Fig 2 Histological expression of VEGF，Flt-1，Flk-1 in the pulp of young and mature permanent teeth

2.2 年輕恒牙和成熟恒牙牙髓VEGF，Flt-1，Flk-1的D值分析

兩獨立樣本 t檢驗，得出年輕恒牙組牙髓VEGF，Flk-1表達比成熟恒牙組的高(P ＜0.05)，而Flt-1的表達比成熟恒牙組中的低(P＜0.05)見表1。

表1 年輕恒牙和成熟恒牙牙髓VEGF，Flt-1，Flk-1陽性染色D值Tab 1 The positive dyeing D value of VEGF，Flt-1，Flk-1 in the pulp of young and mature permanent teeth n=15

2.3 VEGF 、Flt-1、Flk-1 mRNA 的表達

以年輕恒牙和成熟恒牙牙髓標本總RNA進行RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳顯示年輕恒牙和成熟恒牙牙髓標本均在145 bp，162 bp，169 bp位置出現條帶，與預期擴增產物大小一致(圖3)。

VEGF、Flt-1、Flk-1基因相對含量見表2。結果提示:年輕恒牙VEGF及其受體Flt-1、Flk-1的表達分別是成熟恒牙的1.7倍、0.6倍和1.5倍。

表 2 VEGF、Flt-1、Flk-1 mRNA 相對含量Tab 2 The relative content of VEGF，Flt-1，Flk-1 mRNA

圖3 RT-PCR檢測VEGF，Flt-1，Flk-1在年輕恒牙和成熟恒牙中的分子水平表達情況Fig 3 Molecule level expression of VEGF，Flt-1，Flk-1 in the pulp of young and mature permanent teeth

3 討論

牙髓是一種疏松結締組織，位于由牙本質所形成的髓腔內，包含細胞、纖維、神經、血管、淋巴管和其他細胞外基質。牙髓的主要功能是形成牙本質、營養、感覺、防御及修復。牙本質修復過程中血管源性生長因子可誘導局部新生血管形成，是牙本質成功修復的關鍵，其中VEGF是血管生成最強而有效的誘導劑，它通過與VEGF受體的識別后發揮作用。在VEGF受體中，Flt-1與VEGF的親和力比Flk-1高10倍［8］，但不能激活內皮細胞增殖的信號，可能是作為VEGF促血管生成的反向調節因子發揮作用。VEGF刺激內皮細胞的增殖、增加血管的通透性和新血管的生成作用主要是通過結合和激活Flk-1來實現的［9］。本實驗免疫組化結果顯示年輕恒牙和成熟恒牙牙髓組織中均有VEGF、Flt-1、Flk-1免疫反應陽性細胞，且VEGF與Flk-1在年輕恒牙中的表達明顯高于成熟恒牙，說明在促進年輕恒牙根尖發育過程中VEGF能通過與Flk-1結合而發揮誘導人牙髓細胞增殖分化成成牙本質細胞和促進修復性牙本質的形成。而發育成熟的恒牙牙髓組織形成血管相關因子VEGF原有的基礎表達量不足，同時Flt-1表達相對年輕恒牙增強，競爭性地阻抗VEGF與Flk-1的結合，雙重作用的結果導致其牙髓組織血管合成能力的下降，修復性牙本質的修復能力相對年輕恒牙弱。

RT-PCR檢測結果進一步證實年輕恒牙VEGF及其受體Flt-1、Flk-1的表達分別是成熟恒牙的1.7倍及0.7倍、1.3倍，提示年輕恒牙牙髓 VEGF、Flt-1、Flk-1的表達與成熟恒牙存在差異，反映了年輕恒牙牙髓組織血管再生潛力高于成熟恒牙，臨床對年輕恒牙的牙髓修復干預可能可以通過調節VEGF和Flk-1的表達這一新的途徑得以實現。而對成熟恒牙的牙髓修復可能通過增強VEGF或降低Flt-1的表達來干預。已有研究表明VEGF/VEGFR家族信號轉導途徑受多種因素影響，如一個特定的環境，內皮基膜，周圍支持細胞的濃度都可以影響內皮細胞的表型和功能乃至VEGF/VEGFR的生物學效應，血流很可能是激活VEGF/VEGFR的另一個重要因素［10］。年輕恒牙中牙髓血供豐富，脈管管腔大而多，基質細胞充滿整個組織間隙且根尖呈開放狀，有利于牙髓內外血供交流，可能是其血管再生潛力高于成熟恒牙的重要因素。

最大限度地保存牙髓的活力或促進牙髓的再生，是目前牙體牙髓病治療過程中追求的目標。對不同年齡及不同牙髓狀態中VEGF及其相關受體表達的研究，提示將來臨床上利用牙髓組織工程治療不同牙髓狀態的牙髓疾病時，可以依治療需要，將外源性VEGF及相關受體加入到支架和牙髓細胞的復合體中，促進血管再生、參與調節纖維原細胞的分化和神經纖維的生長，最終誘導牙髓完全性修復牙本質的形成［11］;或是利用基因技術，將人VEGF及受體基因轉入種子細胞(如牙髓干細胞或成纖維細胞)，使種子細胞持續產生VEGF和相關受體，為修復性牙本質形成提供足夠的血管化并調節細胞的活性，從而達到治愈牙髓病的目的，這需進一步的動物實驗和臨床驗證研究［12］。

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