鼠IFN-λ2腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

劉洋，袁利學(xué)，步雪峰，嚴(yán)玉蘭

(1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院呼吸科，江蘇鎮(zhèn)江212002;2.黃石市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北黃石435000)

2003 年 Sheppard等［1］和 Otenko等［2］相繼報道了 IFN-λ 家族，包括 IFN-λ1、IFN-λ2 和 IFN-λ3 3 個成員(又稱IL-29、IL-28A 和IL-28B)。IFN-λs具有與Ⅰ型干擾素類似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮抗病毒、抗細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)作用［3］。近來眾多研究表明IFN-λs在體內(nèi)外均具有抗腫瘤細(xì)胞生長作用［4－6］。因此，本實驗構(gòu)建鼠 IFN-λ2 重組腺病毒載體，為后續(xù)進(jìn)一步開展抗腫瘤的研究及基因治療奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;內(nèi)切酶購自TaKaRa公司;T4DNA連接酶購自MBI公司。質(zhì)粒中量提取試劑盒購自Qiagen公司;轉(zhuǎn)染試劑LipofectaminTM2000購自Invitrogen公司;pShuttle-CMV載體、腺病毒的骨架載體、BJ5183菌、pAdEasy，人胚腎293A細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。LA795鼠肺腺癌細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

1.2 方法

1.2.1 鼠脾臟細(xì)胞制備 BALB/c鼠1只，無菌取出脾臟，剝離結(jié)締組織，用不完全培養(yǎng)液清洗后將脾臟經(jīng)200目紗網(wǎng)研磨過濾成單個細(xì)胞，將脾細(xì)胞懸液移至離心管中，800 r/min離心10 min，沉淀用不完全培養(yǎng)液再離心洗滌1次，將細(xì)胞沉淀用含5%胎牛血清的DMEM重懸，移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 引物設(shè)計 按基因庫報告的mIFN-λ2基因全長序列設(shè)計引物，上游引物:5'-GGTACCATGCTCCTCCTGCTGTTGCCTCTGCTGCTGGCCGC-3'，下游引物:5'-AAGCTTTCAGACACACTGGTCTCCACTGGCCACACAC-3'上游引物中引入KpnⅠ位點，下游引物中引入HindⅢ位點。

1.2.3 鼠IFN-λ2基因的RT-PCR克隆 用人水皰口炎病毒按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)1.0感染鼠脾臟細(xì)胞12 h后，Trizol法提取小鼠脾臟細(xì)胞的總RNA，以O(shè)ligod T為反轉(zhuǎn)錄引物用Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板進(jìn)行PCR，PCR的循環(huán)條件:95℃ 熱啟動預(yù)變性5 min，95℃30 s，58℃ 30 s，72 ℃50 s，共 30 個循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖電泳分析。

1.2.4 鼠IFN-λ2基因亞克隆入腺病毒穿梭載體將鼠IFN-λ2 cDNA的PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，用T4DNA連接酶將上述回收的PCR產(chǎn)物與PMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，挑取陽性克隆，送上海生物工程有限公司測序。將測序正確的mIFN-λ2-PMD18-T載體質(zhì)粒用KpnⅠ、HindⅢ雙酶切并用膠回收試劑盒回收，pShuttle-CMV載體用KpnⅠ、HindⅢ雙酶切處理后膠回收，將兩者用T4DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，挑取陽性克隆，并進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.5 同源重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 將重組的腺病毒穿梭質(zhì)粒 pShuttle-CMV-mIFN-λ2用 PmeⅠ37℃單酶切2 h線性化后，用瓊脂糖電泳鑒定后膠回收線性化的重組質(zhì)粒;將BJ5183感受態(tài)細(xì)胞融解，將線性化的穿梭質(zhì)粒及病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1加入BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中混勻進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，涂于LB平板，培養(yǎng)過夜;挑取克隆，質(zhì)粒小提試劑盒法提取質(zhì)粒，PacⅠ單酶切進(jìn)行鑒定。將鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α菌中大量制備。

1.2.6 重組腺病毒的包裝和擴(kuò)增 將構(gòu)建的pAdmIFN-λ2同源重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶線性化酶切后，割膠回收大片段，按LipofectamineTM2000操作說明分別轉(zhuǎn)染293A人胚腎細(xì)胞中進(jìn)行包裝。通過顯微鏡觀察細(xì)胞病理改變，出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)時(++～+++)，將細(xì)胞懸液反復(fù)凍融3次，取第1代重組腺病毒提取基因組進(jìn)行PCR鑒定，檢測重組腺病毒中是否插入目的基因mIFN-λ2。此第1代重組腺病毒粗提液在293A細(xì)胞中經(jīng)多輪感染和擴(kuò)增后獲得較高滴度的pAd-mIFN-λ2重組腺病毒，于－70℃保存待用。

1.2.7 pAd-mIFN-λ2 病毒滴度的測定 采用半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)方法測定pAd-mIFN-λ2病毒滴度，即根據(jù)病毒稀釋到終點時，在293A細(xì)胞中細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的發(fā)生來估算病毒滴度。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測mIFN-λ2蛋白的表達(dá)將處于對數(shù)生長期鼠肺腺癌LA795細(xì)胞種植于6孔板內(nèi)，濃度為1×105/孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)過夜。次日換用無血清 DMEM ，用 pAd-mIFN-λ2及 pAd-LacZ腺病毒以相同的稀釋比例(1∶200)分別感染LA795細(xì)胞，分為4組:細(xì)胞對照PBS組、pAd-LacZ組(3×108pfu/ml)、pAd-mIFN-λ2 組(3 ×108pfu/ml)、pAd-mIFN-λ2 組(2 ×1010pfu/ml)，感染48 h收集上清，冷凍干燥后，提取蛋白，行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后使用羊抗鼠IL-28為一抗，兔抗羊IgG-HRP為二抗進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測。

1.2.9 倒置顯微鏡觀察pAd-mIFN-λ2對鼠肺腺癌細(xì)胞生長的抑制作用 將處于對數(shù)生長期鼠肺腺癌細(xì)胞LA795種植于6孔板內(nèi)，濃度為1×105/孔，次日換含2%胎牛血清的DMEM維持液，分為3組:細(xì)胞對照組，pAd-LacZ 組、pAd-mIFN-λ2 組，在實驗組分別加入3×108pfu/ml的pAd-LacZ及pAd-mIFN-λ2 100 μl，72 h后倒置顯微鏡觀察鼠肺腺癌細(xì)胞的生長情況。

2 結(jié)果

2.1 mIFN-λ2 的 RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

經(jīng)人水皰口炎病毒誘導(dǎo)小鼠脾臟細(xì)胞mRNA表達(dá)并用RT-PCR擴(kuò)增。其產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)大小約為582 bp的條帶，與所需克隆的mIFN-λ2基因大小相一致(圖1)。

圖1 mIFN-λ2的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig 1 Product of mIFN-λ2 amplified by RT-PCR

2.2 pMD18-T-mIFN-λ2 的酶切鑒定

將菌落PCR鑒定陽性的克隆擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒pMD18-T-mIFN-λ2，用KpnⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定，出現(xiàn)約582 bp大小條帶，與目的基因大小完全一致(圖2)。

圖2 pMD18-T-mIFN-λ2的酶切鑒定Fig 2 Identification of pMD18-T-mIFN-λ2 cutted by enzyme

2.3 pMD18-T-mIFN-λ2 的測序

取酶切鑒定陽性的質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果與基因庫中的mIFN-λ2序列完全一致。

2.4 pShuttle-CMV-mIFN-λ2 KpnⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定

挑取陽性克隆感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，進(jìn)行KpnⅠ、HindⅢ雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳分析，出現(xiàn)約582 bp大小的條帶，與目的基因大小完全一致(圖3)。

圖3 pShuttle-CMV-mIFN-λ2 的KpnⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定Fig 3 Identification of pShuttle-CMV-mIFN-λ2 cutted by enzymes KpnⅠ、Hind Ⅲ

2.5 pAd-mIFN-λ2腺病毒質(zhì)粒重組子PacⅠ酶切鑒定

重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mIFN-λ2經(jīng)PacⅠ酶切后，得到兩條基因片段，長度分別約為4.5 kb和30 kb(圖4)。以重組腺病毒質(zhì)粒 pAd-mIFN-λ2為模板，PCR鑒定結(jié)果如圖5，可見約582 bp大小的條帶，與目的基因大小完全一致。

圖4 重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mIFN-λ2酶切鑒定圖Fig 4 Identification of recombinant adenovirus plasmid pAd-mIFN-λ2 cutted by enzyme

圖5 PCR鑒定重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mIFN-λ2Fig 5 Identification of recombinant adenovirus plasmid pAd-mIFN-λ2 using PCR

2.6 重組腺病毒pAd-mIFN-λ2的鑒定

提取轉(zhuǎn)染pAd-mIFN-λ2的293A細(xì)胞腺病毒基因組，PCR擴(kuò)增基因內(nèi)部序列。重組腺病毒擴(kuò)增出582 bp條帶，陰性對照為正常293A細(xì)胞處理組，結(jié)果證明重組腺病毒帶有目的基因(圖6)。

圖6 PCR鑒定重組腺病毒pAd-mIFN-λ2Fig 6 Identification of recombinant adenovirus pAd-mIFN-λ2 using PCR

2.7 腺病毒感染293A細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變效應(yīng)

正常的293A細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，輪廓分明;而重組腺病毒mIFN-λ2感染的293A細(xì)胞開始變圓、腫脹，并有一部分懸浮起來，出現(xiàn)脫落和死亡等典型細(xì)胞病變效應(yīng)(圖7)。

圖7 重組腺病毒感染對293A細(xì)胞的影響(×400)Fig 7 Effect to 293A cells infected recombinant adenovirus

2.8 腺病毒滴度的測定

重組腺病毒pAd-mIFN-λ2經(jīng)過擴(kuò)增后，我們?nèi)〉?代和5代病毒采用TCID50方法來測定病毒滴度。第 5 代 pAd-mIFN-λ2 的 病 毒 滴 度 T=1010.9TCID50/ml，即 2 ×1010pfu/ml。

2.9 mIFN-λ2 蛋白的表達(dá)

鼠肺腺癌細(xì)胞LA795在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，各組處理所收集的上清其mIFN-λ2蛋白經(jīng)蛋白質(zhì)印跡鑒定，細(xì)胞對照PBS組和pAd-LacZ組(3×108pfu/ml)未見 27 000條帶，Ad-mIFN-λ2組(3×108pfu/ml)有一很淺的灰色條帶，而 pAd-mIFN-λ2組(2×1010pfu/ml)出現(xiàn)1條明顯的黑色條帶(圖8)。

2.10 pAd-mIFN-λ2對鼠肺腺癌細(xì)胞生長的抑制作用

分別以3×108pfu/ml的Ad-LacZ及pAd-mIFN-λ2 100μl感染鼠肺腺癌細(xì)胞72 h，倒置顯微鏡下可見對照組細(xì)胞生長正常，pAd-LacZ組細(xì)胞生長受到輕度抑制，pAd-mIFN-λ2組細(xì)胞生長受到明顯抑制(圖9)。

圖8 感染pAd-mIFN-λ2后LA795細(xì)胞mIFN-λ2蛋白的表達(dá)Fig 8 mIFN-λ2 protein expressing in LA795 cells infected by pAd-mIFN-λ2

圖9 pAd-mIFN-λ2對鼠肺腺癌細(xì)胞生長的影響(倒置顯微鏡，×200)Fig 9 Effect of pAd-mIFN-λ2 on the growth of mouse lung adenocarcinoma cells

3 討論

IFN-λs家族有 3 個成員，即 IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)、IFN-λ3(IL-28B)。小鼠的 IFN-λ家族基因全長為582 bp，但只有 IFN-λ2與 IFN-λ3兩型，因為小鼠IFN-λ1基因的第1個外顯子含有一個終止密碼子，不能編碼蛋白。小鼠的IFN-λ2與IFN-λ3同源性為98%，小鼠的 IFN-λ家族與人的IFN-λ家族同源性為60%［7］。IFN-λ家族低劑量的表達(dá)于多種組織文庫中，包括血液、大腦、垂體、肺、胰腺、胎盤、卵巢、前列腺和睪丸，也可以通過雙鏈RNA聚肌胞苷酸誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞或多種病毒(如水皰口炎病毒、登革熱病毒、流感病毒、皰疹病毒、呼吸合胞病毒等)感染腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生［1－2］。

本實驗采用人水皰口炎病毒誘導(dǎo)小鼠原代脾細(xì)胞表達(dá) IFN-λ2，通過 RT-PCR 獲取 IFN-λ2 的cDNA，基因序列測定表明與基因庫公布的序列完全一致。將測序正確的鼠IFN-λ2亞克隆至pShuttle-CMV載體，經(jīng)PmeⅠ線性化后，與腺病毒的骨架載體pAdEasy在BJ5183菌中同源重組，然后轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞進(jìn)行包裝及擴(kuò)增獲得鼠IFN-λ2重組腺病毒。RT-PCR證實包裝成功的重組腺病毒中含有目的基因鼠IFN-λ2，且病毒滴度較高。將重組腺病毒感染鼠肺腺癌細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡法證實有鼠IFN-λ2蛋白的表達(dá)，并能抑制鼠肺腺癌細(xì)胞的生長。

基因治療是一種高效、特異性、靶向性強(qiáng)的治療方法，主要是將目的基因放進(jìn)特定的載體導(dǎo)入人體內(nèi)，在人體細(xì)胞中表達(dá)特定的蛋白達(dá)到治療的目的。腺病毒是目前基因治療研究和臨床試驗中應(yīng)用最廣的病毒載體之一。既往研究表明IFN-λs在體內(nèi)外均有明顯的抗腫瘤作用，且通過調(diào)動機(jī)體免疫系統(tǒng)在殺傷腫瘤過程中占主導(dǎo)地位，其主要機(jī)制是通過激活多形核白細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、NK細(xì)胞并可協(xié)同其他細(xì)胞因子增強(qiáng) IFN-γ 的分泌等來殺傷腫瘤細(xì)胞［4－6］。鼠IFN-λ2重組腺病毒載體的構(gòu)建為以后進(jìn)一步開展體內(nèi)外的抗腫瘤研究及基因治療奠定了基礎(chǔ)。

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