外源性一氧化碳釋放分子對膿毒癥小鼠神經系統抗炎的調節作用

仇雪楓，孫炳偉，王敏，孫艷，楊國濤，王波

(江蘇大學附屬醫院燒傷整形科，江蘇鎮江212001)

膿毒癥是嚴重創傷、休克及感染后常見的并發癥，進一步發展可導致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征，即便在基礎與臨床醫學研究及重癥監護手段高度發展的現代，臨床治療仍然收效甚微，死亡率居高不下。研究發現神經系統在炎癥的發生發展中具有很強大的調控作用，其中以迷走神經及其分泌的遞質乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)所構成的膽堿能抗炎通路的研究較為深入［1］。

近年研究結果證實，一氧化碳(CO)是機體內一種重要的化學氣體信使，參與了炎性反應引起的氧化應激反應［2］、缺血再灌注損傷［3］、內毒素休克［4］等病理過程，發揮著重要的抗炎、抗凋亡和細胞保護作用。外源性一氧化碳釋放分子(carbon monoxidereleasing molecule-2，CORM-2)是近年來新合成的一種一氧化碳復合物，經適當溶劑溶解在生理環境中可以持續釋放CO。本研究組既往的研究證實，外源性一氧化碳能顯著改善膿毒癥時肝、肺、腎等重要臟器的功能，抑制炎癥反應［5－11］。但是否能夠抑制膿毒癥時神經系統的炎癥反應未見報道。本研究采用盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)建立小鼠膿毒癥模型，以CORM-2干預，并用卡巴膽堿做陽性對照，觀察其對膿毒癥小鼠膽堿能遞質的影響作用，旨在研究其對膿毒癥時膽堿能抗炎通路是否有輔助作用，并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

CORM-2、卡巴膽堿、異硫氰酸熒光素標記的α-銀環蛇毒素(FITC-α-BGT)購自美國 Sigma公司，TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒購自美國 Biosource公司，550酶標儀購自美國Bio-Rad公司，TDL-40B臺式低速離心機購自上海安亭科學儀器廠，高速低溫臺式離心機購自美國Beckman公司。

1.2 動物分組及標本收集

6～8周齡C57BL/6小鼠，體質量(20±2)g，雄性，48只，隨機分成4組(每組12只):假手術組、CLP模型組、CORM-2干預組和卡巴膽堿組。CORM-2劑量:8 mg/kg尾靜脈注射。常規飼養1周后實驗。CLP模型制備:用2%異氟烷麻醉，面罩給氧。腹壁中線行1.0 cm切口，尋及盲腸，距盲腸壁1.0 cm處用3－0絲線結扎，20號針于盲腸壁穿孔，輕輕擠壓，見少量腸內容物溢出。將盲腸置入腹腔，關閉切口。假手術組:將小鼠麻醉后，腹中線依層切開，將盲腸由腹腔取出再放回，關閉切口。切口處涂以碘伏。腹腔注射1 ml生理鹽水，單籠飼養，自由進食進水。術后24 h于麻醉狀態下進行心臟采血，1 500 r/min離心，收集血清及腦組織標本，－70℃保存。

1.3 檢測指標

1.3.1 小鼠腦組織的組織學觀察 腦組織塊浸泡固定于10%甲醛溶液。常規脫水，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，光鏡觀察腦組織形態學變化。

1.3.2 腦組織濕/干比測定 剝離小鼠大腦，迅速用吸水紙吸干表面水分和血液，電子天平稱濕重。然后置70℃烘箱內烘烤，并定時稱重至恒重，記錄干重。計算公式:組織含水量=［(濕重－干重)÷濕重］×100%。

1.3.3 腦組織細胞因子TNF-α、IL-6水平檢測 分別用TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒檢測腦組織細胞因子TNF-α、IL-6水平，具體方法參照試劑盒說明書。

1.3.4 腦組織乙酰膽堿濃度檢測 將10 μl的膽堿標準品稀釋到990 μl的膽堿緩沖液中配制成0.5 nmol/μl的膽堿標準品，繪制標準曲線。具體檢測方法按照試劑盒說明書進行。樣品的乙酰膽堿濃度=Cho/Sv，Cho為從標準曲線中得到的樣品讀數(nmol)，Sv是加入到樣品孔中樣品的體積(μl)。

1.3.5 乙酰膽堿酯酶活性的檢測 小鼠心臟采血后，放入盛有3 ml pH7.4的磷酸鹽緩沖液的小試管中，混勻后取出1.5 ml置于另一小試管中，作為測定管;原管作為對照管。向對照管中加入1滴毒扁豆堿溶液，混勻。兩管同置37℃水浴中預熱5 min。向兩管中分別加入已在37℃保溫的5，5'二硫代雙(2-硝基苯甲酸)和碘化硫代乙酰膽堿(ASCh)應用液各0.5 ml。加入ASCh溶液時，立即混勻并計時，在水浴中準確反應6 min后，向測定管中加入l滴毒扁豆堿溶液終止反應，離心除去血細胞。取上清液放入比色杯中，于412 nm波長處，以水為參比，讀取光密度(D)，對照管的光密度為D'，求D－D'值，查標準曲線得全血膽堿酯酶活性單位。

1.4 統計學處理

應用SAS 6.02軟件進行統計處理，計量資料用均數±標準差(±s)表示，各組間差異比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CORM-2對CLP小鼠腦組織病理學改變的影響

假手術組小鼠大腦結構完整清晰，腦組織形態、結構正常，腦回清晰;CLP模型組可見腦組織明顯腫脹，腦回結構紊亂，中性粒細胞聚集和浸潤;CORM-2干預組和卡巴膽堿組:腦組織仍然有水腫，血管擴張充血，但腦細胞變性和中性粒細胞浸潤明顯減輕(圖1)。

圖1 CORM-2干預對膿毒癥小鼠腦組織病理變化的影響(HE×100)Fig 1 Effects of CORM-2 on pathological change in the brain of sepsis mice(HE×100)

2.2 CORM-2對CLP小鼠腦組織濕/干比的影響

與假手術組比較，CLP模型組小鼠腦組織的濕/干比明顯增大(P＜0.05)，顯示腦水腫明顯;與CLP模型組比較，CORM-2干預組和卡巴膽堿組腦組織濕/干比變化不大(P＞0.05)，表明腦組織水腫程度沒有得到明顯改善(圖2)。

圖2 CLP小鼠腦組織濕/干重比Fig 2 Brain W/D ratio in the CLP-challenged mice

2.3 CORM-2對CLP小鼠腦組織細胞因子TNF-α、IL-6水平的影響

與假手術組比較，CLP模型組小鼠腦組織TNF-α、IL-6的表達水平明顯增加(P＜0.01);與CLP模型組比較，CORM-2干預組和卡巴膽堿組TNF-α、IL-6的表達水平明顯下調(P＜0.05)，見表1。

表1 CORM-2對CLP小鼠腦組織細胞因子TNF-α、IL-6水平的影響Tab 1 Effects of CORM-2 on TNF-α and IL-6 production in the brain of CLP-challenged mice n=12

2.4 CORM-2對CLP小鼠腦組織乙酰膽堿濃度和血清乙酰膽堿酯酶活性的影響

與假手術組比較，CLP模型組小鼠的腦組織乙酰膽堿濃度變化不大，CORM-2干預組和卡巴膽堿組乙酰膽堿濃度明顯高于CLP模型組(P＜0.05);血清乙酰膽堿酯酶活性CLP模型組較假手術組組明顯增加(P＜0.01)，CORM-2干預組和卡巴膽堿組較CLP組明顯下調(P＜0.05)，見表2。

表2 CORM-2對CLP小鼠腦組織乙酰膽堿濃度和血清乙酰膽堿酯酶活性的影響Tab 2 Effects of CORM-2 on acetylcholine concentration in the brain and on serum AChE levels in CLP-challenged mice n=12

3 討論

膿毒癥是嚴重創傷、休克及感染后常見的并發癥，進一步發展可導致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征。分析表明，全世界10%的死亡患者與膿毒癥密切相關。由于膿毒癥的病理過程極其復雜，只有致力于闡明其確切的病理生理機制，尋找新的、有效的治療靶點，才有希望逐步解決目前臨床膿毒癥防治的重重困難。

在神經系統調控炎癥反應的過程中，迷走神經及神經遞質乙酰膽堿所構成的膽堿能抗炎通路的抗炎作用逐漸被揭示。膽堿能抗炎通路的研究表明［1］，刺激迷走神經或者直接給予擬膽堿藥物(如煙堿)能明顯抑制體內促炎細胞因子的釋放，減輕炎癥反應。Borovikova等［12］經過體內及體外實驗研究發現，刺激外周迷走神經或直接給予N樣膽堿能受體激動劑煙堿，能顯著抑制內毒素刺激人血巨噬細胞的TNF-α和IL-6等促炎細胞因子的釋放作用，而給予M樣膽堿能受體激動劑毒蕈堿時此抑制作用明顯低于煙堿。卡巴膽堿是一種人工合成的擬膽堿藥物，并同時具有抗膽堿酯酶的間接作用，但其分子結構與煙堿明顯不同。它同時作用于M樣和N樣膽堿能受體，不僅能擴張血管、促進胃腸動力、增加腺體分泌，還能減輕局部和全身炎癥反應。以往的動物實驗研究發現，卡巴膽堿能降低內毒素休克動物血和組織TNF-α水平，改善臟器功能。卡巴膽堿腸內注射能顯著減輕腸缺血再灌注損傷后腸黏膜的炎癥反應和病理損傷［13］。研究還發現卡巴膽堿在膽堿能抗炎通路中通過結合巨噬細胞表面的nAChR α7受體發揮抗炎作用，該作用能被金銀環蛇毒競爭性結合nAChR α7而拮抗，從而抑制乙酰膽堿及煙堿在膽堿能抗炎通路中的作用。

CO作為炎性反應一系列病理生理反應中的一種新的內源性介質和干預因子開始受到重視。既往常采用吸入CO作為外源性CO的來源，它的弊端較多:裝置復雜、吸入濃度較難控制和維持、難以在實驗需要時追加劑量、易導致碳氧血紅蛋白血癥等［14］。近年合成的 CORM，可以通過溶解后釋放CO發揮生理作用，在一定生理劑量時并不提高動物體內碳氧血紅蛋白的濃度。我們既往的研究證實，CORM作為外源性CO的供體，對嚴重燒傷后早期重要臟器(肝、肺、腎、小腸等)的炎性反應具有明顯的抑制作用。但是否能夠抑制膿毒癥時神經系統的炎癥反應未見報道。

本研究通過建立小鼠膿毒癥模型，使用外源性一氧化碳干預，同時使用卡巴膽堿干預作為陽性對照，觀察其對神經抗炎膽堿能通路的干預作用。研究結果顯示，給予外源性一氧化碳干預后膿毒癥小鼠體內膽堿酯酶的活性被下調，從而減少對抗炎神經遞質乙酰膽堿的降解，使得乙酰膽堿能夠在體內存留更長時間，促進其與巨噬細胞表面膽堿能受體的結合，通過細胞內信號轉導來抑制促炎因子的生成和釋放。本組結果還表明，CORM干預后TNF-α和IL-6等促炎細胞因子的釋放均被下調，證實局部或全身的炎癥反應在一定程度上被抑制。

目前CO的抗炎癥反應、抗氧化作用已被實驗證實，CO作用于膽堿能抗炎通路并促進其抗炎作用的詳細機制和量效關系尚需進一步深入的研究，從而為臨床治療嚴重炎癥反應和膿毒癥提供新思路。

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