TGF-β1誘導人肝HL7702細胞發生上皮細胞間質轉化的實驗研究

李婷芬，王冰瑩，嚴永敏，李里明，蔣留留，錢暉

(江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212013)

肝纖維化是一種肝臟正常結構破壞，膠原沉積的過程［1］，目前肝纖維化的發病機制尚有爭議。TGF-β1 是上皮-間質轉化(epithelial-to-mesenchyme transition，EMT)最重要的調節分子，Zeisberg 等［2］發現小鼠肝纖維化中成纖維細胞來源于局部肝細胞經TGF-β1作用發生EMT，骨形成蛋白7(BMP7)抑制EMT后，相應肝纖維化也得到修復。Kaimori等［3］把小鼠原代肝細胞和小鼠肝細胞系AML12做了對比，發現 TGF-β1會誘導成熟的小鼠肝細胞發生EMT轉變。Chen等［4］也發現體外 TGF-β1誘導小鼠肝細胞發生EMT轉變。但是人肝臟纖維化與EMT關系的研究還未見報道。

本實驗旨在探討人肝細胞系HL7702在TGF-β1誘導下是否發生EMT，并檢測EMT相關基因蛋白的表達變化，為進一步研究EMT和肝纖維化之間的具體機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人肝細胞HL7702購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 主要試劑 1640培養基，小牛血清(Gibco公司);人類重組TGF-β1(Peprotech公司);兔抗人多克隆E-鈣黏附蛋白抗體(SAB公司);鼠抗人多克隆N-鈣黏附蛋白抗體(BD公司);鼠抗人多克隆波形蛋白抗體(Santa cruz公司);鼠抗多克隆GAPDH抗體，羊抗鼠IgG，羊抗兔IgG(上海康成公司);Trizol試劑(Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(MBI公司)，SYBR Green熒光染料(ToYoBo公司)。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳培養箱(Forma，Scientific公司)，倒置式生物顯微鏡(Ti，Nikon公司)，PCR儀(2720，ABI公司)，熒光定量 PCR分析儀(CFX96TM，Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 TGF-β1 刺激人肝細胞 HL7702 HL7702 于20%小牛血清(1640)培養基37℃ 5%CO2孵箱中培養，每3天換1次營養液。消化傳代后HL7702分別種于6孔板，細胞濃度為1×107/孔。20%小牛血清(1640)營養液培養2 d后，撤除營養液換成無血清1640 培養基和 TGF-β1 2 ng/ml培養 24，48，72 h后，通過倒置顯微鏡觀察誘導前后細胞的形態變化。

1.2.2 實時定量PCR檢測EMT相關基因 用Trizol試劑提取誘導前后細胞總RNA，以總RNA為模板，Oligo dT為引物，逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，qRT-PCR檢測相關基因的表達量，各引物序列見表 1。qRT-PCR反應體系:10 μl 2 ×SYBR Green 熒光染料，引物1 和引物2 各0.5 μl，Taq DNA聚合酶 0.1 μl，1 μl cDNA，補水至總體積 20 μl。循環35 次:94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃30 s，E-鈣黏附蛋白(80℃)，N-鈣黏附蛋白，Twist(75℃)，β-肌動蛋白(78℃)采集熒光;隨后72℃延伸5 min，最后進行72℃ ～99℃的熔解曲線分析。E-鈣黏附蛋白、N-鈣黏附蛋白、Twist的數據與β-肌動蛋白數據采用相對比值法處理。

表1 引物堿基序列Tab 1 Primer sequence

1.2.3 蛋白質印跡法檢測EMT相關蛋白 誘導組及未誘導組細胞經裂解液充分裂解后，加入等體積5×SDS上樣緩沖液于蛋白裂解上清液中，煮沸5 min。進行聚丙烯酰胺電泳，每孔上樣等量總蛋白。分離的蛋白轉移至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入E-鈣黏附蛋白(1∶200)、N-鈣黏附蛋白(1∶2 000)、波形蛋白(1 ∶500)及GAPDH(1∶10 000)抗體稀釋液，4℃過夜。TBS/0.5%Tween20洗膜3次后，再加入1∶5 000抗HRP抗體稀釋液37℃ 孵育1 h，TBS、0.5%Tween20充分洗膜3次后，用預混HRP化學發光底物(Luminata crescendo western HRP substrate)檢測蛋白。

1.3 數據處理及統計

實驗數據用GraphpadPrism 5軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HL7702細胞誘導前后的形態學變化

體外培養的HL7702細胞的形態是不規則的六邊形，經TGF-β1誘導24 h后細胞形態基本沒有變化，48 h后少量的細胞拉長變成紡錘形，72 h后細胞形態的變化很明顯，大量的細胞完全變成紡錘形，細胞之間的間隙也變大(圖1)。

2.2 TGF-β1誘導后HL7702細胞EMT相關基因表達

通過觀察細胞形態學的變化，選擇72 h的細胞提取總RNA用于定量分析，結果顯示HL7702細胞經誘導72 h后E-鈣黏附蛋白mRNA的表達較對照組明顯減少，差異有統計學意義(t=3.353，P＜0.05)。而 N-鈣黏附蛋白，Twist mRNA 的表達較對照組 HL7702顯著增加(t=3.850，P＜0.05;t=5.433，P ＜0.05)。見圖2。

圖1 TGF-β1誘導前后HL7702細胞的形態學變化(×100)Fig 1 Morphology changes after TGF-β1 induction in HL7702 cells

圖2 TGF-β1誘導后HL7702細胞EMT相關基因mRNA的表達Fig2 Relative EMT-associated gene expression level after TGF-β1 treatment in HL7702 cells

2.3 TGF-β1誘導后HL7702細胞EMT相關蛋白表達

蛋白質印跡結果顯示，HL7702誘導24 h和48 h后E-鈣黏附蛋白基本沒什么變化，72 h后E-鈣黏附蛋白表達明顯減弱(P＜0.001)。而N-鈣黏附蛋白、波形蛋白均隨誘導時間的延長表達明顯增強。見圖3。

3 討論

TGF-β1是一組具有多種功能的蛋白多肽，對細胞的增殖分化、細胞外基質(ECM)形成、組織損傷修復起著重要作用［5］。TGF-β1是肝臟中最主要的成分，隨著對TGF-β1認識逐步加深，人們發現肝纖維化與TGF-β1有重要的聯系。本研究采用TGF-β1作用于人肝細胞系HL7702之后，通過細胞形態學變化，EMT相關基因和蛋白表達分析，證明了肝細胞HL7702經過TGF-β1誘導后確實發生了EMT，上皮化標記E-鈣黏附蛋白顯著下降，間質化標記N-鈣黏附蛋白、波形蛋白和 Twist顯著增加。肝細胞漸漸失去了上皮細胞的特性和功能。

E-鈣黏附蛋白、N-鈣黏附蛋白、波形蛋白和 Twist是EMT的重要檢測指標，TGF-β1廣泛用于EMT的誘導［2-4］。相關研究已表明TGF-β1誘導小鼠的原代肝細胞和肝細胞系發生EMT之后，上皮化標記E-鈣黏附蛋白下降，間質化標記N-鈣黏附蛋白和波形蛋白顯著增加［3-4］，這說明細胞失去了上皮化特性和功能，具有間質化細胞的特性和分泌膠原的功能。在小鼠體內纖維化的實驗中，小鼠肝內大量的成纖維細胞也是由肝細胞經過EMT而來，促使肝纖維化中膠原的形成［2］。研究發現 TGF-β1誘導上皮細胞發生EMT的機制與Snail-1轉錄因子有關。Snail-1轉錄因子是EMT發生的關鍵分子［6-8］，TGF-β1激活 Snail-1與E-鈣黏附蛋白轉錄的抑制有關系，Snail-1是間質化標記波形蛋白的上游分子［9］。Kaimori等［3］發現用Smad4-siRNA干擾小鼠肝細胞后抑制了TGF-β1誘導EMT和Ⅰ型膠原的表達，且依然保留上皮化表型 (E-鈣黏附蛋白)和功能(白蛋白)。

圖3 TGF-β1誘導后HL7702細胞EMT相關蛋白表達Fig3 Expression of EMT-associated proteins after TGF-β1 induced in HL7702 cells

Snail-1是EMT的關鍵分子，那么如果封閉Snail-1轉錄因子之后，是否會抑制TGF-β1誘導人肝細胞發生EMT?TGF-β1/Smads信號通路是EMT發生的重要信號通路，那么Smad4-siRNA干擾之后，即使肝細胞在TGF-β1作用下也不會發生EMT嗎?這些問題將是在此基礎上我們今后要研究的內容。

［1］Friedman SL.Mechanisms of hepatic fibrogenesis［J］.Gastroenterology，2008，134(6):1655-1669.

［2］Zeisberg M，Yang C，Martino M，et al.Fibroblasts derive from hepatocytes in liver fibrosis via epithelial to mesenchymal transition［J］.J Biol Chem，2007，282(32):23337-23347.

［3］Kaimori A，Potter J，Kaimori JY，et al.Transforming growth factor-beta1 induces an epithelial-to-mesenchymal transition state in mouse hepatocytes in vitro［J］.J Biol Chem，2007，282(30):22089-22101.

［4］Chen YL，Lv J，Ye XL，et al.Sorafenib inhibits transforming growth factor β1-mediated epithelial-mesenchymal transition and apoptosis in mouse hepatocytes［J］.Hepatology，2011，53(5):1708-1718.

［5］郭銳芳，楊少奇.以TGF-β1為靶點的抗肝纖維化治療［J］.實用肝臟病雜志，2008，11(5):341-343.

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