甲硫氨酸氨肽酶高通量微型化檢測方法的建立*

楊玉蘭，姜文俠，劉琦，孫瑞雪

1(天津市工業生物系統與過程工程重點實驗室，中國科學院系統微生物工程重點實驗室，中國科學院天津工業生物技術研究所，天津，300308)2(天津科技大學，天津，300457)

氨肽酶(aminopeptidase)是蛋白水解酶中外肽酶的一類，它們能從蛋白質和多肽鏈的N末端順序水解氨基酸，其催化機理可以用下式表示:

甲硫氨酸氨肽酶是氨肽酶中的一種，在蛋白質加工過程中負責切除新生肽鏈N端的起始甲硫氨酸，對細胞的成熟，生長和防御都具有重要的作用，維持著細胞的動態平衡［1］，此外還作為轉錄調控因子、特異性位點的重組因子和毒素受體參與抗生素的活化與轉運［2］。甲硫氨酸氨肽酶特有的水解方式和功能，決定了其廣泛應用于食品、醫藥、發酵、飼料及生物技術等行業［3－6］。目前氨肽酶制劑主要應用于功能肽的制備和蛋白質水解食品的生產加工過程，用以提高營養質量，改善產品的最終風味。由于氨肽酶能促進不良口感疏水肽的水解、釋放其他具有愉快口感的肽和自由氨基酸［7］，氨肽酶已經成為水解蛋白脫苦制劑的首選。

菌種是工業發酵生產氨肽酶的物質基礎，從自然界篩選并在實驗室誘變進化一直是發現和創新工業微生物菌種的重要手段。常規的菌種選育方法工作量大、周期長、效率低、成本高［8］。采用高通量方法篩選新型的氨肽酶和氨肽酶高產菌株，既可提高工作效率，降低成本，又能大幅度地提高篩選速度［9－10］。但高通量篩選氨肽酶產生菌關鍵程序中酶活測定的工作量非常大，消耗的試劑也很多，特別是用于酶活測定的底物價格昂貴。為了使測定方法更加方便迅速，降低消耗，以適應微量化發酵培養的酶活測定，實現真正意義上的高通量篩選，本文在對硝基苯胺法的基礎上，對3種不同來源的甲硫氨酸氨肽酶進行檢測條件的優化，建立適應高通量篩選的微量化檢測方法——酶標板法，并與常規的對硝基苯胺法進行比較以驗證該方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養基

甲硫氨酸氨肽酶產生菌11-11-16-2-5AL、11-10-18-7-AL和12-3-16-14AL，為本實驗室分別從麥醬、臭豆腐和腐乳中分離。

種子培養基(g/L):麥芽糊精8，酵母粉2，蛋白胨8，KH2PO41，MgSO40.2，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基(g/L):麥芽糊精15，酵母粉10，蛋白胨5，牛肉膏2，KH2PO42.7，MgSO40.1，NaCl 1，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 主要試劑和儀器

甲硫氨酸對硝基苯胺(sigma公司，分析純)，對硝基苯胺(sigma公司，分析純)，其它均為市售分析純。

全功能微孔板檢測儀(Bio-Tek)，紫外分光光度計(普析通用 TU-1810PC型)，酶標板(Greinerbio-one)，8道自動移液器(BRAND)，臥式恒溫振蕩器(精騏 IS-RDH1型)，電熱恒溫水浴鍋(泰斯特);高速冷凍離心機(Hettich)，48孔深孔板(上海甘薇)。

1.3 溶液

氨－氯化銨緩沖液(40 mmol/L):稱取1.07 g NH4Cl溶于90 mL蒸餾水中，以5%的氨水調pH至8.0，定容至100 mL。

底物溶液(6 mmol/L):稱取0.016 g甲硫氨酸對硝基苯胺，于10 mL蒸餾水中50℃水浴至完全溶解，定容至10 mL。

終止液:50%的乙酸水溶液。

對硝基苯胺溶液:準確稱取對硝基苯胺，以蒸餾水配制400 μmol/L溶液，然后將其依次稀釋至150、200、250、300 μmol/L 和 350 μmol/L。

1.4 粗酶液的制備

分別挑取甲硫氨酸氨肽酶產生菌11-11-16-2-5AL、11-10-18-7-AL和12-3-16-14AL的單菌落接入種子培養基中，于36℃搖床200 r/min培養6～8 h，制備種子液。將種子液按5%接種量，接種至發酵培養基，于36℃搖床200 r/min培養24 h，為甲硫氨酸氨肽酶的發酵液。將發酵液于4℃、10 000×g離心得上清液，即為甲硫氨酸氨肽酶的粗酶液。

1.5 酶活的測定

酶活測定的原理:氨基酸對硝基苯胺溶液無色，在氨肽酶的作用下水解生成黃色的對硝基苯胺和游離的氨基酸。對硝基苯胺在紫外范圍有吸收，以紫外分光光度法測定其吸光度，計算氨肽酶的酶活。

酶活的定義:于60℃，pH 8.0，每分鐘水解氨基酸對硝基苯胺產生1 μmol對硝基苯胺所需的酶量，定義為一個酶活單位(U)。

常規對硝基苯胺法［11－12］:向比色管中加入2 mL NH3-NH4Cl緩沖液和1 mL底物溶液，再加入l mL稀釋一定倍數的粗酶液，60℃水浴反應10 min，反應結束立即加入終止液6 mL，終止反應。空白對照以蒸餾水代替粗酶液。以紫外分光光度計于380 nm測定吸光度，根據標準曲線計算酶活。

酶標板法:在酶標板的微孔中加入40 μL NH3-NH4Cl緩沖液和20 μL底物溶液，然后加入20 μL經適當稀釋的粗酶液，加蓋子后置于60℃水浴反應10 min，反應結束立即加入終止液120 μL，終止反應。空白對照以蒸餾水代替粗酶液。以酶標儀于380 nm測定吸光度，根據標準曲線計算酶活。

2 結果與分析

2.1 酶反應條件的優化

2.1.1 pH對酶反應的影響

反應液的pH值對酶活測定的影響很大，酶在一定條件下都有其最適pH。最適pH的測定在以下50 mmol/L的緩沖液中進行:乙酸鈉(pH 4.0～5.5)、Na3PO4(pH 6.0～7.0)、Tris－HCl(pH 7.5～8.5)和HBO3-NaCl(pH 9.0～11.0)，其它測定條件不變［13］。酶活測定結果如圖1所示。

圖1 pH對酶活的影響

從圖1可見3株菌的甲硫氨酸氨肽酶均在pH 8.0左右時活力最高，而當pH低于5.5或高于10.5時未檢測到酶活，表明它們是弱堿性氨肽酶，在強酸和強堿環境中失活。

2.1.2 緩沖液濃度的選擇

考察pH 8.0的濃度為10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L 和 100 mmol/L 的Tris-HCl緩沖液對氨肽酶活性的影響，結果如圖2所示。

圖2 緩沖液濃度對酶活的影響

從圖2可知3種氨肽酶在緩沖液濃度為20～80 mmol/L的范圍內活力較強，其中Tris-HCl濃度為40 mmol/L時酶活力最強。

2.1.3 底物溶液濃度的選擇

考察底物濃度在2～10 mmol/L范圍對酶活反應的影響，結果見圖3。

圖3 底物濃度對酶活的影響

底物甲硫氨酸對硝基苯胺的濃度影響酶促反應速度，從圖3可以看出，隨著底物濃度的增加三種氨肽酶的酶活也相應升高，底物濃度達到6～7 mmol/L時酶活最高，但當底物濃度超過7 mmol/L時，酶活反而降低。考慮到底物成本，故可選擇底物濃度為6 mmol/L。

2.1.4 反應溫度對酶活的影響

測定在10～100℃范圍內，溫度對酶活的影響，結果見圖4。

圖4 溫度對酶活的影響

隨著溫度的增加3種酶的活力也均相應升高，當溫度為60℃時酶活力最高。

2.1.5 反應時間對酶活測定的影響

在5～20 min的酶反應時間范圍內，測定酶的最佳反應時間，結果見表1。從表1可以看出，酶解時間在10 min時酶活最高。

表1 酶解時間對酶活測定的影響

2.1.6 緩沖液的離子對酶活測定的影響

反應體系中緩沖液的離子影響酶蛋白的空間結構，從而影響其催化能力，所以，測定酶活時應盡可能統一反應緩沖液的種類和離子強度。考察KH2PO4、Tris-HCl、H3BO3-NaOH、NH3-NH4Cl、2-氨 基-2-羥 甲基-(1，3)丙二醇-HCl緩沖液對3種氨肽酶活的影響，緩沖液的濃度均為40 mmol/L，pH均為8.0，其它測定條件不變，結果如表2。在NH3-NH4Cl的緩沖液中酶活最高。

表2 緩沖液離子對酶活的影響

從上述結果可看出三種不同來源的甲硫氨酸氨肽酶酶活檢測的最適條件相同，確定甲硫氨酸氨肽酶活性測定的酶反應條件為:40 mmol/LNH3-NH4Cl緩沖液，pH 8.0，底物甲硫氨酸對硝基苯胺濃度6 mmol/L，反應溫度60℃，反應時間10 min。

2.2 酶標板法與常規對硝基苯胺法的對比

2.2.1 酶標板法和常規對硝基苯胺法的光吸收曲線比較

酶標板法和常規對硝基苯胺法的光吸收曲線見圖5和圖6。2種方法的最大吸收峰均在380 nm左右，酶標板法與常規對硝基苯胺法的光密度一致。

圖5 酶標板法對硝基苯胺的光吸收曲線

2.2.2 酶標板法和常規對硝基苯胺法線性范圍的比較

配制系列梯度濃度的對硝基苯胺標準溶液，以純水為對照，在380 nm波長處，分別用酶標板法和常規對硝基苯胺法測定對硝基苯胺的含量。以吸光度為橫坐標，以對硝基苯胺濃度為縱坐標，繪制標準曲線，兩種方法測定的標準曲線分別如圖7、圖8。酶標板法對硝基苯胺的標準曲線滿足回歸相關系數0.999以上的回歸直線，兩個端點所對應的對硝基苯胺濃度為20.720～55.252 μg/mL，與常規方法一致。

圖6 常規法對硝基苯胺的光吸收曲線

圖7 酶標板法測定酶活的標準曲線

圖8 常規法測定酶活的標準曲線

2.2.3 酶標板法和常規對硝基苯胺法酶活測定結果的比較

對三種不同來源的氨肽酶粗酶液樣品，分別用酶標板法和常規對硝基苯胺法進行酶活測定，每種粗酶液平行測定3次，取平均值。測定結果及2種檢測方法的相對標準偏差見表3，由表3的結果可看出，酶標板法和常規法檢測氨肽酶酶活的結果基本一致。

表3 酶標板法和常規法酶活測定的結果對比

3 討論

目前，氨肽酶的酶活測定方法有對硝基苯胺(pNA)法及熒光底物法［14］。熒光底物法以氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)為底物，反應一定時間，測定水解產物的熒光性，該法迅速靈敏，但熒光底物價格昂貴，成本遠遠高于對硝基苯胺法。國內外氨肽酶的檢測多采用對硝基苯胺法，大多選擇405 nm波長處比色測定［12，14］，本文通過對對硝基苯胺進行波譜掃描，確定其在380 nm具有最大吸收值，故采用380 nm的波長進行酶活測定，以提高檢測的靈敏度。

采用對硝基苯胺法測定氨肽酶酶活，通過添加氨基酸對硝基苯胺底物，可以篩選水解肽鏈N端不同氨基酸的氨肽酶及其高產菌。氨肽酶微量化檢測方法，與常規的對硝基苯胺法相比，操作簡單方便、消耗的試劑少、檢測成本低、工作效率高，與微型化發酵培養相結合，可以實現氨肽酶產生菌真正意義上的高通量篩選。

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