糖化酶水解大豆異黃酮*

孫潔心，張永忠

1(黑龍江農墾職業學院，黑龍江 哈爾濱，150025)2(東北農業大學應用化學系，黑龍江哈爾濱，150030)3(教育部大豆生物學重點實驗室，黑龍江哈爾濱，150030)

大豆異黃酮是大豆生長過程中形成的一類次生代謝產物，分為3類，即黃豆苷類(daidzin groups)、染料木苷類(genistin groups)、黃豆黃素苷類(glycitin groups)，以游離型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等4種形式存在［1－2］。大豆異黃酮中97%～99%是以大豆異黃酮糖苷形式存在，苷元形式僅為大豆異黃酮總量的1% ～3%［3］。從20世紀80年代起，很多研究報道及動物實驗表明，大豆異黃酮具有許多突出的生物學功能［4－5］，如弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性等，能有效預防和抑制骨質疏松、乳腺癌、前列腺癌等多種疾病的發生［6－8］。然而，研究表明，這些功能主要來自于苷元形式的大豆異黃酮［9］，糖苷形式的大豆異黃酮只有在腸道微生物作用下降解為有活性的苷元形式，才能發揮其生理功能［10］。但腸道內微生物的水解作用很弱，因此，開發高活性的大豆異黃酮苷元類產品一直是國內外研究的熱點。國內市場上，大豆異黃酮保健品中活性成分多為糖苷形式，較高生物活性的異黃酮苷元類深加工產品尚未見到［11－12］。

游離型苷元——染料木黃酮和黃豆苷元的制備常常采用水解的方法［13－15］。國外主要研究酶水解的方法，酶水解具有條件溫和、苷元不易變性等優點。本課題組進行了糖化酶水解大豆異黃酮的研究，并與黑曲霉β-葡萄苷酶水解大豆異黃酮相比較，其水解效率相差不多。但目前國內市場上并沒有β-葡萄苷酶產品出售，而糖化酶早已實現工業化生產，其市場價格十分低廉，易于用于大規模苷元型大豆異黃酮的生產。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

30%大豆異黃酮粉，黑龍江省糧食研究所;糖化酶，北京奧博星生物技術公司;染料木黃酮、黃豆苷元、染料木苷和黃豆苷標準品，sigma公司;甲醇為色譜純;冰醋酸等為國產分析純試劑。

1.2 儀器

HZS-H水浴振蕩器，哈爾濱東明醫療儀器廠;PHS-25型pH計，上海精科雷磁儀器廠;AL104電子天平，上海天平儀器廠;高效液相色譜儀，P682HPLC泵，UVD170U紫外檢測器，ASI-100自動進樣器、色譜柱 Nova-Pak C18柱(3.9 mm ×150 mm，4 μm)，美國戴安公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜法檢測大豆異黃酮含量

測定條件:流動相為V(甲醇)∶V(0.5%乙酸)=40∶60，柱溫 50℃，流速 1.0 mL/min，檢測波長 254 nm，進樣量10 μL。

標準曲線的繪制:分別準確稱取標準品染料木苷(genistin)和黃豆苷(daidzin)各1 mg、染料木黃酮(genistein)和黃豆苷元(daidzein)各5 mg，用甲醇(色譜純)分別定容到10 mL容量瓶中，制成標準儲備液。然后分別從各標準儲備液中吸取一定量，用甲醇稀釋到 1 μg/mL、2 μg/mL、3 μg/mL、4 μg/mL、5 μg/mL待測。以峰面積(y)為縱坐標，大豆異黃酮濃度(x)為橫坐標，對各組分濃度與峰面積關系進行回歸分析，并繪制標準曲線。

1.3.2 酶活力測定

1 g酶粉在40℃、pH值為4.6條件下，每小時分解2%的可溶性淀粉產生1 mg葡萄糖的酶量定義為1個酶活力單位。

1.3.3 酶水解反應體系與水解效率測定方法

向250 mL錐形瓶中加入30%大豆異黃酮粉后，加入糖化酶，然后加入150 mL某一pH值的乙酸－乙酸鈉緩沖溶液，在一定溫度下，水浴振蕩器中進行水解反應。將反應液在80～90℃加熱5 min，使酶滅活。經HPLC檢測以染料木苷水解率為檢測指標，計算水解率:

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 酶的添加量

向10只250 mL錐形瓶中各加入100 mg大豆異黃酮粉后再分別加入 10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg、80 mg、90 mg 和 100 mg 糖化酶，然后加入150 mL pH值為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，在58℃的水浴振蕩器中水解24 h。確定反應體系中酶的添加量。

1.3.4.2 底物濃度的確定

向6只250 mL錐形瓶中分別加入100 mg、500 mg、1 000 mg、1 500 mg、2 000 mg 和2 500 mg 大豆異黃酮粉，加入100 mg糖化酶，然后加入150 mL pH值為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，在58℃的水浴振蕩器中水解24 h。確定反應體系中底物的濃度。

1.3.4.3 酶水解反應的最佳pH值

向6只250 mL錐形瓶中各加入500 mg大豆異黃酮粉和100 mg糖化酶后，再分別加入150 mL pH值為3、3.5、4、4.5、5 和 5.5 的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，在58℃的水浴振蕩器中水解24 h。確定反應體系的最佳pH值。

1.3.4.4 酶水解反應的最佳時間

向6只250 mL錐形瓶中各加入500 mg大豆異黃酮粉和100 mg糖化酶后，再加入150 mL pH值為4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，在58℃的水浴振蕩器中分別水解 3、6、9、12、15、18 和21 h。確定反應體系的最佳時間。

1.3.4.5 酶水解反應的最佳溫度

向6只250 mL錐形瓶中各加入500 mg大豆異黃酮粉和100 mg糖化酶后，再加入150 mL pH值為4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，在溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃的水浴振蕩器中水解6 h。確定反應體系的最佳溫度。

1.3.5 正交試驗確定水解反應的最適反應條件

根據單因素試驗結果，確定加酶量和底物濃度并選擇水解時間、水解pH值和水解溫度為影響因素，采用3因素3水平做正交試驗設計，確定最佳的水解條件。因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

確定最佳水解條件后，進行驗證試驗。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜法測定大豆異黃酮標準曲線(表2)

表2 標準曲線

2.2 糖化酶酶活力的測定

經測定糖化酶的酶活力為38 U/mg。

2.3 單因素試驗

2.3.1 酶的添加量

以150 mL pH值為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液為介質，向100 mg大豆異黃酮粉中加入不同量的糖化酶，水解大豆異黃酮，水解效率如圖1所示。

圖1 酶添加量的影響

實驗結果表明，隨著酶添加量的增加，水解率不斷的提高，當加酶量為 100 mg時，水解率可達86.80%。

2.3.2 底物濃度的確定

以150 mL pH值為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液為介質，添加不同質量的大豆異黃酮粉進行水解反應，水解效率如圖2所示。

圖2 大豆異黃酮濃度的影響

試驗結果表明，在異黃酮粉的加入量為500 mg/150 mL時水解率達到最大，當大豆異黃酮粉加入量大于500 mg時會有異黃酮粉掛在反應容器器壁上，減小了提取率。

2.3.3 酶水解反應的最佳pH值

以150 mL不同pH值的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液為介質，加入500 mg大豆異黃酮及100 mg的糖化酶，水解大豆異黃酮，水解率如圖3所示。

圖3 水解pH值的影響

實驗結果表明，水解率在pH值為4.5時最高。

2.3.4 酶水解反應的最佳時間

在其他條件一定的情況下，控制不同的水解時間，其大豆異黃酮的水解率如圖4所示。

實驗結果表明，隨著水解時間的增加，水解率提高。水解18 h，水解率達到最大，為93.56%;當超過18 h，水解率反而下降。

2.3.5 酶水解反應的最佳溫度

在其他條件都確定的情況下，控制不同的水解溫度，水解效率如圖5所示。

實驗結果表明，在50℃水解，水解率達到了最大值，為96.69%。超過55℃，水解率顯著降低，因為溫度過高會使酶變性失活。

圖4 水解時間的影響

圖5 水解溫度的影響

2.4 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，確定加酶量和底物濃度，選擇水解時間、水解pH值和水解溫度為影響因素，采用3因素3水平進行正交試驗，確定最佳水解條件。這里時間因素的選擇是因為水解時間為6 h時與水解時間為18 h時水解率的差別不大，出于縮短時間，降低水解成本的考慮將，水解時間因素的水平定為5 h、6 h和7 h。結果見表3。

表3 正交實驗結果分析表

通過對表3極差分析的結果可以看出，3因素對水解率的影響程度依次為B＞C＞A，影響大豆異黃酮水解效率的主要因素是水解時間，其次是水解溫度。通過單因素試驗和正交試驗設計確定了糖化酶水解糖苷型大豆異黃酮的最佳水解工藝是:溫度55℃，pH值4.8，時間7h。水解率可達到98.18%。

3 結論

本研究對糖化酶水解糖苷型大豆異黃酮的加酶量、底物濃度、pH值、時間和溫度進行了單因素試驗，并以單因素試驗的結果為依據，以pH值、時間和溫度為因素進行了3因素3水平的正交實驗。確定了糖化酶水解大豆異黃酮的最佳條件為:水解溫度55℃，pH值4.8，時間7h。水解率可達98.18%。

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