湘西傳統酸魚中乳酸菌的分離及特性研究*

曾雪峰，夏文水

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

我國的淡水魚產量高居世界首位，但由于淡水魚的含水量大、土腥味重、不易貯藏的原料特性及淡水魚制品加工中關鍵技術的缺失等原因，致使目前淡水魚的加工量還不足淡水魚養殖產量的15%，遠遠落后歐美日等發達國家的水平。應用生物發酵方法來保持和改善肉類制品的品質或抑制腐敗菌的生長是一種很好的食品加工保藏方法［1］。湘西傳統酸魚是我國湖南湘西地區一種傳統淡水全魚發酵制品，產品具有酸辣適口、回甜咸鮮、香氣獨特、回味醇厚、保質期長等特點。是一種高蛋白、低脂肪、生物胺含量低、富含多種游離氨基酸的功能性食品。但湘西傳統發酵全魚制品大多是手工作坊式生產，自然發酵微生物種類的安全性難以保障，生產周期長，質量不穩定，安全性差，工業化程度低。

湘西傳統發酵肉制品中棲息著種類繁多、數量豐富的微生物，主要是乳酸菌［2］。麻成金等人對湘西傳統酸肉的優勢乳酸菌進行了分離篩選，選育出具有產酸快、發酵特性好、符合產業化要求性狀的米酒乳桿菌作為發酵劑［2］。而迄今為止，對湘西酸魚中乳酸菌的菌種特性尚無相關報道。考查這種傳統美食中存在的乳酸菌菌株特性，對研究湘西傳統酸魚的風味、質構、色澤及貯藏性具有相當的理論指導意義，對改進我國淡水全魚發酵制品傳統發酵工藝、實現其工業化生產具有重要現實意義。本研究從湘西傳統淡水全魚發酵制品中分離的196株乳酸菌株進行了菌群分布分析、產酸速率、耐鹽耐硝酸鹽、抑菌性、氨基酸脫羧酶活性等試驗，以期得到適合工業化生產發酵魚制品的優良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株篩選樣品

本課題分別選取湘西鳳凰、花垣兩種優質傳統低鹽發酵酸魚作為菌株分離樣品。其中鳳凰低鹽酸魚標為XXF;花垣低鹽酸魚標為XXH。

1.1.2 實驗材料

蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、瓊脂、酵母膏、溴甲酚紫、精氨酸、半胱氨酸等為BR級。

乙酸鈉、NaCl、檸檬酸二銨、KH2PO4、MnSO4、Mg-SO4、NaOH、HCl、醋酸鉛、Na2SO3、CaCO3等試劑均為AR級。

1.1.3 實驗儀器與設備

相差顯微鏡(XSS-2);潔凈工作臺(HS-1300);電蒸恒溫培養箱(XMT-152A);紫外可見分光光度計(WFZ UV-2100);電子天平(FA 1104);手提式壓力蒸汽滅菌鍋(YQX-LS-18SI)。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基［3］

MRS培養基、硝酸鹽還原試驗培養基、精氨酸產氨培養基、葡萄糖產氣培養基、產H2S培養基、產H2O2檢測用培養基、明膠液化培養基、淀粉水解培養基、產黏液培養基、醋酸鹽瓊脂培養基。

1.2.2 酸魚制作方法

依照湘西傳統酸魚制作工藝方法，稱取體重100～150 g的新鮮鯉魚，經去鱗、取鰓、除內臟，清水洗凈，并根據當地消費者的喜好，按一定比例添加食鹽和各種香辛料，混合均勻后置冰箱中腌制24 h后，曬制2 d，以除去部分水分，然后與適量谷類化合物混勻，并在魚肚中塞入部分谷類化合物，陶瓷壇的底部鋪上部分碳水化合物作為底料，層魚層輔料，壓緊，頂部鋪上一層輔料后鋪上一層朔料，加蓋封嚴。自然溫度發酵成熟。XXF和XXH的具體生產工藝及配方詳見表1。不同生產階段(0，10，20，30，40 d)的酸魚樣品被分別收集置于冰箱中保存備用。

表1 湘西傳統發酵酸魚工藝條件

1.2.3 乳酸菌的分離鑒定

無菌操作，分別準確稱量25 g XXF、XXH，絞碎后各自加225 g的無菌生理鹽水，振蕩搖勻后梯度稀釋至適宜濃度，無菌移取0.1 mL稀釋樣液，均勻涂布到D 9 cm固體MRS培養基中，30℃培養48 h后挑取可疑乳酸菌菌株反復劃線培養，獲得純菌株。并對分離純化菌株的菌落形態、革蘭氏染色、葡萄糖產酸試驗及過氧化氫酶試驗進行初步菌株特性鑒定。其中革蘭氏陽性和過氧化氫酶陰性的菌株被保存在－18℃，含30%甘油的液體MRS培養液中。采用APICHL50系統對分離的菌株鑒定到種。

1.2.4 生理生化實驗［3］

經分離的乳酸菌，通過葡萄糖產氣試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、運動性試驗、產硫化氫試驗、醋酸鹽試驗、產黏性試驗、精氨酸產氨試驗、溫度試驗對其菌株特性進行分析。

1.2.5 產酸速率實驗［4］

將分離得到的不同乳酸菌株接種到MRS液體培養基中培養，同時以未接種的MRS液體培養基作空白對照，30℃培養0，4，8，12，16，20和24 h后分別測定其pH值。

1.2.6 耐鹽性實驗、耐亞硝鹽實驗［4］

將活化后待測乳酸菌株以1%(V/V)接種至含有 4%、6%、10%的 NaCl濃度，50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg的NaNO2濃度液體MRS培養基中，分別在30℃厭氧培養36 h和24 h，同時做空白對照，于λ=600 nm處測定其OD值。

1.2.7 耐酸和膽鹽實驗［5］

將分離的菌株30℃過夜培養活化，取0.5 mL的細菌培養液接種于10 mL的磷酸鹽緩沖液中，用5 mol/L HCl分別調 pH 值至2.5、3.9、9.6，初始菌液濃度調為106～108CFU/mL，置于37℃培養3 h。取2 mL活化菌液分別接種于8 mL含0.1%、0.2%和0.3% 膽鹽的MRS培養液中培養4 h后測定活菌數。存活菌數采用平板活菌數計數法，計算其活菌數。菌株的存活率為MRS瓊脂平板測得的活菌數與初始菌數的百分比。

1.2.8 抑菌性實驗［4］

取經上述試驗的分離菌株活化后，在MRS液體培養基中30℃培養48 h，離心取發酵上清液。選用大腸桿菌、李斯特桿菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌，分別取0.1 mL經活化12 h的大腸桿菌、李斯特桿菌和金黃色葡萄球菌菌液涂布于基礎培養基上，在指示菌平板上間隔打孔，分別在每個孔內滴加200 μL乳酸菌發酵上清液，30℃培養24 h后測量各待測菌株抑菌圈的大小。

1.2.9 氨基酸脫羧酶實驗

將活化后的待測菌株分別按1%(V/V)接入添加有1%(m/V)組氨酸、酪氨酸、賴氨酸及鳥氨酸的含0.06%溴甲酚紫作為指示劑的MRS培養液中，30℃厭氧培養7天后觀察培養液顏色變化，顏色由黃變紫表示菌株氨基酸脫羧酶活性陽性。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

從湘西傳統發酵酸魚中共分離出201株菌株，其中革蘭氏陽性菌、葡萄糖產酸和過氧化氫酶陰性菌株196株。XXF中分離出96株，XXH分離出100株。分離出的菌株菌落光滑整齊、短桿或球狀、白色、透明或不透明、菌落呈圓形、表面濕潤光滑、邊緣整齊、形態微小、菌落直徑在1.0～2.0 mm之間，201株疑似乳酸菌株中有98株革蘭氏陽性球菌、98株革蘭氏陽性桿菌、1株革蘭氏陰性球菌、4株革蘭氏陰性桿菌、桿菌呈短桿狀，兩端平直或稍彎曲，無芽孢，無鞭毛，球菌多呈單個分布。

API鑒定結果表明湘西傳統酸魚中分離的196株乳酸菌種類及含量分別是:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)(32.1%)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)(28.1%)是主要的乳酸菌菌株，接著是明串珠菌(Leuconostoc)(21.9%)、食品乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)(14.3%)，以及零星的腸球菌(Enterococcus durans)和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。由表2可知，戊糖片球菌和植物乳桿菌是發酵過程中的第一優勢菌，而明串珠菌在發酵的初始階段占據優勢，在發酵后期已不再有明串珠菌檢出，食品乳桿菌在發酵中后期保持穩定。明串珠菌在發酵起始階段好氧發酵產酸，抑制了好氧菌、不耐酸及其它微生物的生長，隨著發酵時間的延長和pH值的降低，耐酸的植物乳桿菌和戊糖片球菌成為了酸魚的主要優勢菌群，從而授予產品獨特的風味和較長的保存期。

表2 湘西傳統發酵酸魚發酵期間乳酸菌群的消長變化

2.2 乳酸菌的生理生化實驗

將分離出的乳酸菌株進行菌種特性試驗，結果見表3:試驗結果表明所有的菌株均未產氣、不具有硝酸鹽還原性、無運動性、不產硫化氫;所有菌株均能在15℃條件下生長，部分菌株在4℃下能生長以及少部分菌株在45℃時能生長;1株(1.6%)植物乳桿菌和1株(1.8%)戊糖片球菌在蔗糖培養基上具有產黏特性;2株(3.2%)植物乳桿菌、3株(5.5%)戊糖片球菌、1株(3.6%)食品乳桿菌和1株(33.3%)腸球菌水解精氨酸產氨。

表3 湘西傳統發酵酸魚乳酸菌生理生化試驗

2.3 產酸速率實驗

作為產品優良發酵劑乳酸菌菌株的檢測指標之一，快速的菌株產酸速率能有效增強菌株的抑菌性、加速產品風味的形成、提高產品凝膠性能及促進產品色澤形成等。研究結果表明:5株植物乳桿菌和3株戊糖片球菌顯示了更快的產酸速率(圖1和圖2所示)，在30℃，16 h和24 h內分別使pH迅速降至4.0以下，且產酸速率沒有顯著差異(P≥0.05)，食品乳桿菌、明串珠菌和干酪乳桿菌的產酸速率明顯低于植物乳桿菌和戊糖片球菌(P≤0.05)。

圖1 5株典型乳酸菌30℃的產酸率

2.4 耐食鹽，耐亞硝鹽實驗

制作肉制品發酵劑所選用的菌株，根據Smith和Palumbo［7］的報道，耐受6%的食鹽和100 mg/L的亞硝鹽是作為適合肉制品發酵劑的特性之一，它們在提高產品貯藏性、抑制有害微生物、穩定肉制品色澤及促進產品風味形成方面發揮著重要的作用。根據比濁法原理，以菌株在MRS液體培養基中OD值的變化，作為微生物生長指標，研究菌株的耐鹽和耐亞硝酸鹽特性。試驗結果如表4所示。

表4 湘西傳統酸魚分離的乳酸菌在耐食鹽、亞硝酸鹽濃度

由表4可得出，所有菌株均能耐受4%的食鹽濃度，68.3%植物乳桿菌、52.7%戊糖片球菌及38.5%食品乳桿菌能耐受6%的食鹽濃度，所有的菌株均不能耐受10%的食鹽濃度。85.5% 植物乳桿菌、81.1% 戊糖片球菌能耐受150 mg/mL的亞硝鹽。

2.5 耐酸及耐膽鹽實驗

發展新型功能性的發酵肉制品，要求足夠數量能耐受胃酸和膽汁環境的益生菌。因而，依據菌種特性和篩選標準，我們對傳統酸魚中存在的能耐受模擬胃腸道環境的乳酸菌進行了探討、分析和篩選。由表5能夠得出:41.3% 植物乳桿菌、37.6%戊糖片球菌及21.3%食品乳桿菌能耐受pH 2.5的胃酸環境2 h以上，活菌存活數量均達到106CFU/mL，而其余菌株的活菌數量大多在102－104CFU/mL，人體胃酸pH值一般在1.5～4.5之間，據此可得出，傳統酸魚中存在部分能耐胃酸的優質乳酸菌。實驗結果表明:21.7%植物乳桿菌、18.3% 戊糖片球菌及11.4% 食品乳桿菌能耐受0.3%的膽鹽4 h，活菌存活數量保持在107CFU/mL水平，其余菌株的存活數量僅有102～103CFU/mL，人體小腸中膽鹽的含量一般在0.03～0.3之間，且食物在小腸中的停留時間大多在1～4 h，由此可知:傳統酸魚中存有部分能耐受0.3%膽鹽的乳酸菌株。其中，5株植物乳桿菌和3株戊糖片球菌具有較好的耐受胃酸和膽鹽能力。

表5 湘西傳統酸魚分離的乳酸菌耐酸、膽鹽特性

2.6 抑菌性實驗

乳酸菌的大量繁殖，乳酸的酸化和菌株產生細菌素抑制食品腐敗菌和致病菌產生。因而，研究傳統酸魚制品優勢乳酸菌的抑菌性試驗也為我們提供了篩選酸魚優良發酵劑的理論和實踐依據。在分離的乳酸菌株中，82.4%植物乳桿菌、87.7% 戊糖片球菌、81.2% 食品乳桿菌、74.6% 明串珠菌和100% 干酪乳桿菌產生抑制大腸桿菌的抗菌物質。92.5% 植物乳桿菌、93.2% 戊糖片球菌、88.1% 食品乳桿菌、90.3% 明串珠菌和100% 干酪乳桿菌產生抑制金黃色葡萄球菌和李斯特桿菌的抗菌物質。分離的3株腸球菌均不能抑制大腸桿菌。其中，4株植物乳桿菌和3株戊糖片球菌的抑制3種指示菌株的抑菌圈都在10 mm以上(表6所示)。

表6 湘西傳統發酵酸魚分離的乳酸菌株抑菌性

2.7 氨基酸脫羧酶實驗

發酵肉制品中的部分乳酸菌具有氨基酸脫羧酶活性，尤其在低pH值和高水分含量的條件下，它們往往脫羧某些特定的氨基酸，生成酪胺、組胺、尸胺、腐胺及苯基乙胺。這些化合物不僅劣化了食品的風味，而且對人體的健康會產生嚴重的危害。因而，研究傳統酸魚中的乳酸菌是否具有氨基酸脫羧酶活性，對了解酸魚的安全品質及產品是否具備推廣價值具有十分重要的意義。根據表7所示:在分離的196株乳酸菌株中，僅有1株植物乳桿菌、2株 腸球菌、1株明串珠菌具有氨基酸脫羧酶活性。

表7 湘西傳統酸魚分離的乳酸菌氨基酸脫羧酶活性

3 結論

(1)從湘西傳統酸魚共中分離出196株乳酸菌，并對其進行了鑒定，發現植物乳桿菌和戊糖片球菌是主要的優勢菌株。

(2)分別對196株乳酸菌株進行生理生化、產酸速率、耐鹽及亞硝酸鹽、耐酸、耐膽鹽、抑菌性、氨基酸脫羧酶及生長曲線的菌株特性研究。

(3)實驗發現3株植物乳桿菌(Lp-7，Lp-10，Lp-21)和1株戊糖片球菌(Pp-27)具有產酸速率快，耐鹽、耐酸、耐膽鹽、無氨基酸脫羧酶活性，適合開發成淡水魚發酵制品發酵劑的潛力。

［1］Hammes W P，Haller P，Ganzle M G.Fermented meat In Handbook of fermented functional foods，Farnworth，W R(ed)［M］.Boca Raton，FL:CRC Press，2003:251－275.

［2］車科，麻成金，黃群，等.湘西傳統酸肉乳酸菌分離、篩選及鑒定［J］.中國釀造，2008，188:25－28.

［3］凌代文.乳酸菌分類鑒定及試驗方法［M］.北京:中國輕工業出版社，1999:117－129.

［4］Salim Ammor，Eric Dufour，Monique Zagorec.Characterization and selection of Lactobacillus sakei strains isolated from traditional dry sausage for their potential use as starter cultures［J］.Food Microbiology，2005，22:529－538.

［5］Pennacchia C，Ercolini D，Blaiotta G.Selection of Lactobacillus strains from fermented sausages for their potential use as probiotics［J］.Meat Science，2004，67:309－317.

［6］Mauriello G，Casaburi A，Blaiotta G.Isolation and technological properties of coagulase negative staphylococci from fermented sausages of Southern Italy ［J］.Meat Science，2004，67:149－158.

［7］JL Smith，SA Palumbo.Use of Starter Cultures in Meats［J］.Journal of Food Protection，1983，46:997－1 006.