苦參堿誘導宮頸癌Hela細胞的凋亡作用＊

西電集團醫院（西安710077） 王 麗 蘇寶山 吳 靜

苦參堿（Mat）是從我國傳統中藥苦參中提取的一種生物活性成分，具有廣泛的藥理學作用［1］。Mat有抗心率失常，抗炎，抗病毒，調節免疫，抗變態反應等作用，現已被廣泛應用于臨床各科［2，3］。目前大量的體內外研究證實，Mat可明顯抑制腫瘤細胞的增殖，誘導其向正常分化和凋亡，研究較多的是Mat對肝癌細胞及白血病細胞的作用，但對宮頸癌Hela細胞的研究尚少，本實驗旨在研究Mat對宮頸癌Hela細胞的增殖及凋亡的影響，為Mat應用于宮頸癌的臨床治療提供實驗依據。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 人宮頸癌Hela細胞株：由西安交通大學醫學院癌癥研究所惠贈。

1.2 主要試劑（如無特指均為國產分析純試劑）：Mat純度為98%，購自陜西昂盛生物醫藥科技有限公司；RPMI-1640培養基為美國GIBCO產品；小牛血清（BCS）杭州四季青生物工程材料研究所；MTT（四甲基偶氮唑鹽）和碘化丙啶（PI）為美國Sigma公司產品。

1.3 主要儀器和設備：CO2培養箱（SHEL-LAB型，美國），超凈工作臺，倒置光學顯微鏡（OLYMPUSCK40型，日本），酶標比色儀（450型，美國Bio-Rad公司），流式細胞儀（Coulter Epics XL）。

2 方 法

2.1 細胞培養：將宮頸癌Hela細胞用含10%小牛血清（BCS），青霉素100U／ml，鏈霉素100ug／ml的RPMI 1640培養基，置于37℃、含5%CO2飽和濕度培養箱孵育傳代培養，每天觀察細胞。

2.2 顯微鏡下觀察不同濃度Mat作用宮頸癌Hela細胞后細胞形態學的變化。

2.3 MTT法檢測Mat對Hela細胞的增殖抑制影響：收集對數增殖期細胞，培養液配成單細胞懸液，計數，調整細胞密度為5×104／ml，接種于96孔培養板，每孔100μl。將Hela細胞分為Mat組及對照組分別加藥。Mat組的終濃度依次為：0.5mg／ml、1.0mg／ml、1.5mg／ml、2.0mg／ml。每個濃度均設4個平行復孔，每孔總體積200μl，以不加藥組為對照組（細胞懸液100μl、培養液100μl）。另設調零孔，只加培養液200μl。共同于37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中培養24h、48h、72h后，每孔加入 MTT（5mg／ml）20μl，繼續于上述環境中培養4h后棄去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）各150μl，微型震蕩混合儀震蕩15min，使結晶物完全溶解，酶聯免疫儀上選擇波長490nm，以調零孔調零后，測定每孔吸光度值（OD值）。

重復以上實驗3次，按下列公式計算細胞生長抑制率：

細胞生長抑制率（%）＝［1-（實驗組OD490均值／對照組OD490均值）］×100%

2.4 Annexin V FITC／PI雙標染色，流式細胞儀測定Hela細胞凋亡率：將不同濃度Mat作用不同時間的宮頸癌Hela細胞EDTA消化、PBS洗滌離心2次，緩沖液重懸細胞，吸取100μl細胞懸液于流式管中，加入5μl Annexin V FITC、10μl PI，混勻后避光孵育15min，在加入400μlPBS，流式細胞儀分析細胞凋亡。

結 果

1 各組細胞培養結果 苦參堿各處理組細胞培養72h后，光鏡下均見貼壁細胞脫落，變圓，體積縮小，懸浮于培養液中，胞質內見較多顆粒，色深，呈深褐色；胞核顏色加深，折光性增強。而且隨著苦參堿濃度增加，培養液中脫落死亡細胞數增加。對照組細胞脫落甚少，背景干凈，Hela細胞呈多角形，貼壁生長良好，胞質飽滿，相鄰細胞生長已連接成片（見圖1、圖2）。

2 MTT增殖抑制實驗結果 不同濃度Mat作用于Hela細胞不同時間，均能不同程度抑制其生長，并且隨Mat濃度增加及培養時間延長抑制率增強，呈現時間-劑量依賴性；不同濃度組，作用不同時間 Mat對Hela細胞的抑制率在3.2%～44.8%之間，以2.0mg／mlMat作用于Hela細胞72h抑制作用最強，抑制率為44.8%，不同濃度Mat、作用不同時間，與對照組相比，統計學分析結果顯示差異均有顯著性﹙P＜0.05﹚。測得OD值見表1，計算所得不同濃度組抑制率見表2及圖3。

圖1 正常生長的Hela cells（DABx400）

圖2 苦參堿作用后的Hela cells（DABx400）

圖3 苦參堿抑制Hela細胞生長曲線

表1 Mat對宮頸癌HeLa細胞的增殖抑制作用（±s，n＝4）

表1 Mat對宮頸癌HeLa細胞的增殖抑制作用（±s，n＝4）

Mat（mg／ml）OD 24h 48h 72h 0.0 0.680±0.002 0.685±0.001 0.692±0.004 0.5 0.658±0.005 0.655±0.007 0.632±0.005 1.0 0.603±0.001 0.583±0.005 0.547±0.001 1.5 0.529±0.002 0.508±0.003 0.470±0.004 2.0 0.458±0.004 0.401±0.002 0.382±0.002

表2 不同濃度Mat對宮頸癌Hela細胞的抑制率

3 流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡率 Hela細胞經不同濃度苦參堿作用24、48、72h后，細胞凋亡率隨苦參堿濃度增加及作用時間的延長而明顯升高，各濃度組及作用時間段與對照組相比均有顯著差異性﹙P＜0.05，見表3）。

表3 不同濃度Mat誘導宮頸癌HeLa細胞的凋亡率

討 論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發病機制復雜，至今尚不明確。對宮頸癌早期診斷、早期治療達到了前所未有的水平。但是，對中晚期宮頸癌的綜合治療，5年存活率及生活質量仍較低。人們早已發現從中草藥及天然植物中提取的活性成分有抑制腫瘤細胞的增殖，殺傷腫瘤細胞的作用，如臨床上常用的抗癌藥物如長春新堿、紫杉醇等都是從天然中草藥中提取成分，跟蹤分離篩選、結構改造與化學合成的，多年來的臨床應用表明，它們的抗癌療效顯著，現已成為臨床抗癌的常用藥，廣泛用于各種腫瘤的化療。

苦參是傳統中藥之一，又名野槐、山槐、地參等，從苦參中可分離出23種生物堿，其中主要是Mat和氧化苦參堿［4］，其中Mat的藥理作用廣泛，隨分子生物學的發展，目前對Mat抗腫瘤研究已經成為中藥抗癌研究之熱點，大量研究已經證明Mat有抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡、分化等作用，同時具有減輕放化、療毒副作用、升高白細胞、提高機體免疫力，逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥（MDR），增加化療藥對腫瘤細胞的敏感性［5，6］。凋亡是由基因控制的細胞程序性死亡，屬于細胞生理性死亡，通過細胞凋亡，機體能及時清除過多的、受損的或惡變細胞，維持機體內環境的穩定。人們越來越認識到凋亡與腫瘤的發生、發展和治療密切相關。

本實驗用不同濃度Mat作用于體外培養的宮頸癌Hela細胞24h、48h、72h后，顯微鏡下觀察細胞形態，發現Hela細胞由原來的多邊形，貼壁、形態飽滿，連接成片變成體積縮小、變圓，脫落懸浮于培養液中，胞質、胞核顏色加深；采用MTT法測定Mat對宮頸癌Hela細胞增殖抑制作用；流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡率，結果發現不同濃度的Mat、作用不同時間對宮頸癌Hela細胞的增殖均有抑制作用，可誘導Hela細胞凋亡，說明Mat對宮頸癌Hela細胞有抑制作用，可作為中晚期宮頸癌的治療的輔助用藥。

近年來對凋亡機制研究的不斷深入，使得我們利用凋亡機制治療腫瘤成為可能。從凋亡途徑機制中尋找治療腫瘤靶點，現已有報道，能否應用于臨床，還有待進一步研究。

［1］肖培根.新編中藥志［M］.北京：化學工業出版社，2002，555-561.

［2］張寶恒，王年生，李學軍，等.苦參堿的抗心率失常作用［J］.中國藥理學報，1990，11（3）：253-257.

［3］陳小文，樊國強.苦參堿注射液治療慢性乙型肝炎效果分析［J］.南華大學學報（醫學版），2006，34（4）：132-134.

［4］馬方勵，程 怡.苦參堿多種制劑的藥效學研究進展［J］.中成藥，2004，26（5）：420-422.

［5］李旭芬，張蘇展，鄭 樹，等.苦參堿對K562及多藥耐藥細胞K562／vin的細胞生物學影響［J］.中國病理生理雜志，2002，18（10）：1233.

［6］李文瑜，李舜華，崔克義，等.苦參堿逆轉的白血病多藥耐藥細胞系K562／AO2對柔紅霉素耐藥性的研究［J］.中國病理生理學雜志，1998，14（5）：521.