高鹽負荷上調SHR胸主動脈、腸系膜上動脈壁AT1和AT2受體表達實驗研究＊

西安交通大學醫學院第一附屬醫院心血管內科（西安710061）

呂 穎 孫超峰△ 殷艷蓉 張軍波 潘軍強 韓穩琦 周 鑫 楊 琳＃

鹽是高血壓的一個重要環境因素，高鹽攝入大動脈彈性的增齡性改變以及對血管局部腎素-血管緊張素系統 RAS的影響［1］。

血液循環中的腎素-血管緊張素系統RAS通過對血容量及外周阻力的控制，調節機體的血壓及水、電解質平衡，而局部RAS參與細胞生長發育，在血壓維持及高血壓病的發生發展中起著極其重要的作用。血管局部RAS中最主要的效應物AngⅡ（血管緊張素Ⅱ）質參與大動脈僵硬化的形成［2］。AngⅡ與AT1（血管緊張素Ⅱ的1型受體）結合后，除強有力的血管收縮作用、促醛固酮分泌之外，能刺激細胞因子如TGF-B（轉化生長因子-B）、骨橋蛋白等的產生，促進細胞增殖和肥大，促進細胞外基質積聚，還有促纖維化和促炎癥反應的作用。AT2（血管緊張素II的2型受體）可能在病理狀態下的心血管系統中存在過表達，對抗AngⅡ通過AT1介導的生物效應，參與血管舒張、抑制增殖、促進凋亡及組織分化［3］，現報告如下。

材料與方法

1 材 料 51周齡組雄性SHR共60只（第四軍醫大學動物實驗中心提供），0.4%NaCl及4%NaCl飼料由西安交大醫學院動物中心配置。試劑來源：一抗①Anti-Human AT2cat＃AT21-A，Aff.Pure Bat.＃3369A4 100ug低壓凍干粉adi4生物制劑公司，②Anti-RAT AT1cat＃AT11-A，Aff.Pure Bat.＃332930A2L100ug／100ul溶液adi4生物制劑公司；二抗試劑盒：SA1022即用型SABC免疫純化試劑盒兔IgG1／2KIT（武漢博士德生物工程有限公司）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。其余試劑均為國產分析純。鼠尾測壓儀為RBP-I型大鼠血壓心率測定儀（中日友好醫院臨床研究所制造）。

2 方 法

2.1 測血壓：所有動物自由飲水，環境12∶12h光暗循環，溫度：18～25℃，濕度：45%～65%，氨濃度：＜20mg／L，換氣量：1.27m／h。兩組SHR大鼠預適應1w后應用鼠尾血壓計檢測尾動脈收縮壓（SBP），測量3次，取平均值。干預后，再次檢測SBP。

2.2 標本固定、取材、包埋及染色：SHR大鼠末次測血壓后第二天，稱重后苯巴比妥鈉（50mg／kg）麻醉，4%多聚甲醛灌注取材，后固定24h，石蠟包埋，5 μm切片后Mallory染色，免疫組化SABC法（一抗濃度1∶50）測定ATR表達譜的改變，以每個視野的陽性物質的灰度值（gray density）表示蛋白表達水平。

2.3 圖像采集及統計分析：采用德國Leica公司QWin550CW圖像系統進行采集與分析。Mallory三色染色：藍色膠原纖維（Ⅰ型和Ⅲ型）的累積光密度值（IOD），顯示纖維化程度。免疫組化SABC法染色：高倍鏡下，選3個血管視野，測定每個視野的陽性物質的灰度值（gray density）。數據以均數±標準差（±s）表示，采用SPSS10.0軟件進行統計分析。計量對正態分布且方差齊同資料采用單因素方差分析檢驗，各組之間兩兩比較用LSD-U法。P﹤0.05具有統計學意義。

結 果

1 高鹽或低鹽干預前后兩組SHR收縮壓比較

高鹽或低鹽干預前高鹽及低鹽組收縮壓比較無顯著性差異（P＞0.05），干預后，高鹽組收縮壓高于低鹽組（P＜0.05），見表1。

表1 干預前后高鹽及低鹽組SHR收縮壓的比較（±s）

表1 干預前后高鹽及低鹽組SHR收縮壓的比較（±s）

注：干預后高鹽組較低鹽組＊P＜0.05。

組 別 n 干預前SBP（mmHg）干預后SBP（mmHg）30 167±16.5161.3±10.8高鹽組 30 164±15.7190±19.3低鹽組＊

2 鹽負荷對血管壁膠原纖維的影響 高鹽或低鹽干預后，胸主動脈及腸系膜上動脈高鹽組IOD均高于低鹽組（P＜0.01），見表2、圖1。

表2 SHR低鹽組和高鹽組動脈Mallory染色IOD值的比較

圖1 鹽干預對腸系膜上動脈血管壁纖維化的影響（Mallory染色 ×100）

3 鹽負荷對血管壁ATR表達譜的影響 高鹽或低鹽干預后，胸主動脈高鹽組AT1、AT2蛋白表達均高于低鹽組（P＜0.01），AT1／AT2比值增大（P＜0.05）；腸系膜上動脈高鹽組較低鹽組AT1蛋白表達增加（P＜0.01），AT2蛋白表達增加（P＜0.05），AT1／AT2比值無明顯變化（P ＞0.05）；見表3、圖2。

表3 鹽負荷對血管壁ATR表達譜的影響（±s）

表3 鹽負荷對血管壁ATR表達譜的影響（±s）

注：表示兩亞組間比較＊P＜0.05；表示兩亞組間比較，＊＊P＜0.01。

組別AT2低鹽組 28 151±12 193±8.2 0.83±0.06 28 151±11 189±12 0胸主動脈n AT1 AT2 AT1／AT2腸系膜上動脈n AT1 AT2 AT1／0.79±0.12.79±0.06高鹽組 27 115±11＊＊ 180±12＊＊ 0.80±0.08＊ 27 135±22＊＊ 170±12＊

灰度值（gray degree）與圖象顏色深度呈反相關，即灰度值越大，圖象顏色深度越淺，表示蛋白的表達越少。

圖2 鹽負荷對腸系膜上動脈血管壁AT1表達的影響（×100）

討 論

本研究中，高鹽負荷后SHR的收縮壓升高，此結果與以往的流行病學研究高鹽飲食導致人群血壓升高的結果一致［4］。Mallory染色顯示胸主動脈及腸系膜上動脈的高鹽組血管壁纖維化較低鹽組均明顯增加，與Hu等［5］低鹽負荷后脈搏波測定動脈僵硬度降低，均提示高鹽負荷與SHR的血管壁重塑相關。

鹽是獨立于血壓、年齡、腎臟變化的導致血管重塑的危險因素。長期以來，鹽介導的血壓升高歸因于短期的血容量增加和長期的小動脈功能及結構的變化所致的血管阻力增加，本研究同期實驗也證實鹽負荷后SHR血漿中血漿C型利鈉肽（CNP）降低內皮素-1（ET-1）升高［6］。然而，鹽介導的心血管系統的改變不僅僅局限于小動脈，也可能存在于大的中心傳導動脈及肌性中動脈。本實驗中，胸主動脈及腸系膜上動脈分別屬于中心性動脈及肌性中動脈，高鹽負荷導致在循環RAS受抑制情況下，局部ATR表達上調可能是這兩類動脈重塑的機制之一。Tobain［7］首次證實高鹽導致SHR動脈重塑，管壁的增厚與膠原纖維的沉積及內分泌網絡系統功能異常有關。以上結果支持本實驗中，鹽與大、中動脈重塑相關，可能與血管局部內分泌系統激活有關。

Georg等［8］采用放免、Northern blotting和 PCR法分別從受體蛋白和mRNA水平證實了高鹽對SD大鼠主動脈AT1表達起上調作用，同時用體外高鹽孵育血管平滑肌細胞（VSMC）的結果與上述在體實驗一致，提示高鹽負荷可能通過直接上調AT1參與了高血壓的形成。除AngⅡ外，高鹽負荷激活的血管局部醛固酮及機械應力均可作用于AT1，醛固酮使腸系膜動脈或VSMC的AT1二聚體蛋白水平升高，引起細胞內谷氨酰胺酶濃度上升，引起血管收縮［9］。

病理狀態下，AT2增多，高鹽時AT2的增高可能繼發于AT1的增高，發揮一定的代償作用。有研究發現，血壓和局部AngⅡ增加將持續上調AT2的表達。而高鹽負荷下，SBP及組織AngⅡ表達均升高，也可能是AT2的表達持續上調的機制之一。胸主動脈及腸系膜上動脈的AT1和AT2在高鹽負荷時表達均上調，導致兩者比值無明顯變化，AT2持續發揮拮抗AT1的效應。

本實驗中高鹽負荷下，AT1蛋白在胸主動脈及腸系膜上動脈表達較低鹽負荷明顯增高，說明了局部RAS系統在老年收縮期高血壓時大、中動脈重塑形成和發展過程中可能起了重要作用。AT2在胸主動脈及腸系膜上動脈高鹽亞組表達亦顯著高于低鹽亞組。在腸系膜上動脈，鹽負荷對AT1和AT2表達的影響較胸主動脈更為顯著，可能與腸系膜上動脈屬于肌性動脈，而胸主動脈屬于彈性動脈，腸系膜上動脈VSMC含量多于胸主動脈，而AT1和AT2表達于VSMC和內皮細胞（EC）有關。與Corriu等發現由正常血管壁中收縮型VsMC轉變為損傷血管中AT1表達增高的增殖型VSMC一致。

SHR大鼠隨著高鹽喂養血壓升高，胸主動脈及腸系膜上動脈膠原纖維沉積明顯增加；AT1及AT2表達均增加，特別是腸系膜上動脈壁；而對AT1／AT2比值未見明顯影響。這一結果提示，血管壁局部ATR的改變可能是高鹽負荷導致血管壁重塑的機制之一，減少鹽的攝入對預防高血壓動脈病變的發生和發展有著重要的意義。

［1］M E Safar，Ch Thuilliez，V Richard，et al.Pressure-independent contribution of sodium to large artery structure and function in hypertension ［J］.Cardiovascular Research，2000，46：269–276.

［2］Serneri G G，Boddi M，Cecioni I，et al.Cardiac angiotensin II formationin the clinical course of heart failure and its relationship with left ventricular function［J］.Circ Res，2001，88（9）：96.

［3］Luis C M，Jia Q H，Helmay M S.Angiotensin AT2Receptor Stimulation Inhibits Early Renal Inflammation in Renovascular Hypertension［J］.Hypertension，2011，57：308-313.

［4］Gu D，Rice T，Wang S，et al.Heritability of blood pressure responses to dietary sodium and potassium intake in a Chinese population ［J］.Hypertension，2007，50（1）：116-122.

［5］Hu J，Jiang X，Li N，et al.Effects of salt substitute on pulse save analysis among individuals at high cardiovascular risk in rural China：a randomized control trail［J］.Hypertens，2009.32（4）：282-288.

［6］孫超峰，高海燕，呂 穎等.高鹽攝入對自發性高血壓大鼠循環血液中CNP及ET-1的影響［J］.陜西醫學雜志，2007，8，36（8）：939-942.

［7］Safar M E，Thuilliez Ch，Richard V，et al.Pressure-in dependent contribution of sodium to large artery structure and function in hypertension［J］.Cardiovascular Research，2000，46：269–276.

［8］Georg N，Kerstin S，Joyg R，et al.Salt Induces Vascular AT1Receptor Overexpression in Vitro and in Vivo［J］.Hypertention，1998，31：1272-1277.

［9］Masahiro Y，Motoi K，Tomohiro O，et al.Vasoconstrictor effect of aldosterone via angiotensin II type 1（AT1）receptor：possible role of AT1receptor dimerization［J］.Cardiovascular Research，2008，79（1）：169-178.