生物素標記試劑的合成方法改進及其在DNA合成中的應用

楊明蓉, 唐 卓, 陳應春

(1. 四川大學 華西藥學院,四川 成都 610041; 2. 中國科學院 成都生物研究所,四川 成都 610041)

近年來，核酸探針雜交技術在醫療科研和臨床中被廣泛采用，成為一項直接檢查病原體、癌基因、遺傳病基因突變等的重要手段。用于雜交的核酸探針必須先進行標記，可分為同位素標記和非同位素標記兩大類。生物素標記的核酸探針屬于非同位素標記，它是利用親和素對生物素有極高親和力的原理，分子雜交后用親和素或鏈霉親和素進行檢測[1～4]。生物素標記探針穩定，不失活，并能配用多種檢測系統，簡單方便。

Richard T Pon[5]設計合成了一種較為理想的生物素標記試劑——[1-N-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-生物素-6-氨基己基]-2-氰乙氧基-N,N-二異丙基亞磷酰胺(3)。3所含的6-氨基己基側鏈顯著增加了生物敏感性[6]，同時3中的二甲氧三苯基增加了穩定性，不僅有利于寡核苷酸鏈的合成與純化，而且還可以在DNA合成儀上通過顏色變化檢測連接效率。

為了推進3的應用，本文改進文獻[5]方法，先將生物素與DMTrCl(4,4′-二甲氧基三苯基氯甲烷)反應制得1-N-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)生物素(1); 1與6-氨基-1-己醇在氯甲酸乙酯中縮合制得1-N-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)生物素-6-氨基己醇(2); 2與磷試劑2-氰乙氧基-雙(N,N-二異丙基)亞磷酰胺(Ⅰ)[7]反應合成了3(Scheme 1)，總收率51.0%,其結構經1H NMR,13C NMR,31P NMR和MS確證。

改進方法將文獻[5]路線由5步簡化為3步，提高了生物素的轉化率,同時避免了昂貴的硅試劑及TBAF(四丁基氟化銨)的使用。

為了驗證改進方法的可行性，本文還采用固相亞磷胺三酯法，應用3合成了一段含有十個堿基的5′-端Biotin標記的寡核苷酸鏈Biotin-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A(記為Biotin-A10)[8～11]，其結構經MS確證。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

Yanaco型顯微熔點儀(溫度計未校正);Brucker-600 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑,TMS為內標)；Alltech HPLC 1500型液相色譜儀(HPLC); Bruker Daltonics ESI-Bio TOF-Q型高分辨質譜儀;ABI 394型DNA合成儀。

硅膠300目～400目，其余所用試劑均為分析純;反應均在無水條件下進行，所用試劑都需作無水處理。

1.2 合成

(1)1的合成

在反應瓶中依次加入生物素2 g(8.2 mmol)的吡啶(40 mL)溶液, DMTrCl 8.32 g(24.6 mmol), Et3N 828 mg(8.2 mmol)和DMAP(4-二甲氨基吡啶) 250.4 mg(2.08 mmol),攪拌下于70 ℃反應4 h。濃縮后用氯仿稀釋，分液，有機相用5%檸檬酸鈉溶液洗滌三次，無水硫酸鈉干燥，濃縮后經硅膠柱層析[洗脫劑:V(甲醇) ∶V(二氯甲烷)=3 ∶97]純化得橙紅色固體13.36 g,收率75.0%;1H NMR(DMSO-d6)δ: 1.43～1.64(m, 6H, CH2), 2.16～2.19(m, 4H, SCH2, COCH2), 3.11(m, 1H, SCH), 3.72(s, 6H, OCH3), 4.27～4.33(m, 2H, NCH), 6.70(s, 1H, NH), 6.84(d, 4H, ArH), 7.22(m, 9H, ArH), 11.94(s, 1H, CO2H)。

(2)2的合成

在圓底燒瓶中加入11.65 g(3.02 mmol)的THF(16 mL)溶液和Et3N 306 mg(3.02 mmol),攪拌下于0 ℃緩慢滴加氯甲酸乙酯654 mg(6.04 mmol),滴畢，反應1 h;冷卻至-20 ℃，加入6-氨基-1-己醇608 mg(6.04 mmol),反應過夜。加水稀釋后用氯仿(3×100 mL)萃取，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥，濃縮后經硅膠柱層析[洗脫劑:V(甲醇) ∶V(二氯甲烷)=1 ∶20]純化得白色固體21.56 g,收率79.3%;1H NMRδ: 1.24～1.70(m, 14H, CH2), 2.15(t, 2H, NCH2), 2.25～2.60(m, 2H, COCH2), 3.08～3.23(m, 3H, CHS), 3.60(t, 2H, OCH2), 3.80(s, 6H, OCH3), 4.36(m, 2H, NCH), 5.10(s, 1H, NH), 5.63(s, 1H, NH), 6.81(d, 4H, ArH), 7.22(m, 9H, ArH)。

(3)3的合成

在反應瓶中依次加入2645 mg(1 mmol)的無水乙腈(10 mL)溶液，四氮唑140 mg(2 mmol), DIPA(N,N-二異丙胺)242.3 mg(2.4 mmol)和Ⅰ 600 mg(2 mmol),攪拌下于室溫反應2 h。用二氯甲烷(200 mL)稀釋，分液，有機相依次用5%碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮后經硅膠柱層析[洗脫劑:V(Et3N) ∶V(氯仿)=1 ∶19]純化得白色固體3724 mg,收率85.7%, m.p.148 ℃～150 ℃;1H NMRδ: 1.21(m, 12H, CH3), 1.24～1.90(m, 14H, CH2), 2.17(t, 2H, NCH2), 2.22～2.60(m, 2H, COCH2), 2.65(t, 2H, CH2CN), 3.08～3.30(m, 3H, CHS), 3.53～3.78(m, 4H, OCH2), 3.80(s, 6H, OCH3), 4.35(m, 2H, CHN), 5.13(s, 1H, NH), 5.61(s, 1H, NH), 6.81(d, 4H, ArH), 7.22(m, 9H, ArH);13C NMRδ: 11.44, 24.55, 24.60, 24.66, 25.23, 25.61, 26.63, 29.50, 39.31, 42.96, 43.01, 46.20, 54.41, 55.23, 58.20, 59.66, 65.40, 72.74, 112.79, 117.77, 126.86, 127.48, 129.74, 131.30, 135.83, 135.91, 143.86, 158.39, 161.81, 172.92;31P NMRδ: 147.81(s); ESI-MSm/z: 868{[M+Na]+}。

1.3 3在合成DNA中的應用

在反應瓶中加入0.1 mol·L-13的乙腈溶液,置DNA合成儀上，在一段含10個A堿基的寡核苷酸鏈(A10)的5′-端連接3；其N-DMT(N-上的4,4′-二甲基三苯基甲基保護基)經5%三氯乙酸/二氯甲烷脫去后于55 ℃氨解10 h。經反相HPLC純化(條件見表1)得目標序列Biotin-A10; ESI-MSm/z: 3 474。

表 1 Biotin-A10的反相HPLC純化條件*Table 1 Purification conditions of reversed-phase HPLC for Biotin-A10

*Apollo C18柱(4.6 m×250 mm, 5 μm);柱溫30 ℃;檢測波長260 nm;流動相A: Et3N·AcOH buffer(pH 7.0),流動相B:乙腈,流速1.0 mL·min-1;進樣量20 μL; tA10=17.86 min, tBiotin-A10=21.44 min

2 結果與討論

本文以文獻[5]工作為基礎，改進合成3的方法。由1合成2采用混合酸酐法，利用氨基與羥基反應活性的差異一步生成酰胺，避免了羥基的保護與脫保護，簡化了反應步驟。

由2合成3選用Ⅰ為磷試劑比2-氰基乙氧基-N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺(Ⅱ)[5]的穩定性更好、后處理方便、且原料轉化率高，3總收率達51.0%。此外，Ⅰ可大量合成，相對于昂貴的Ⅱ成本大大降低，有利于工業化生產。

本文將3應用于合成DNA,成功地制得Biotin-A10，充分顯示了3在合成DNA中的廣闊應用前景。

為了提高生物素的轉化率，DMTrCl, 6-氨基-1-己醇， Ⅰ均要過量;因為Ⅰ易被氧化，由2合成3應在氮氣保護下進行。

[1] Merr Wilchek, Bayer E A. The avidin-biotin complex in bioanalytical applications[J].Analytical Biochemistry,1988,171:1-32.

[2] 馬風林. 生物素標記核酸探針技術[J].生物化學與生物物理進展,1989,16(27):15-17.

[3] Fang S Y, Guan Y S, Ernest R Blatchley. Conjugation of (E)-5-[2-(methoxycarbonyl)ethenyl]cytidine to hydrophilic microspheres:Development of a mobile microscale UV light actinometer[J].Bioconjugate Chem,2008,19:592-597.

[4] Misiura K, Durrant I, Evans M R. Biotinyl and phosphotyrosinyl phosphoramidite derivativesuseful in the incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides[J].Nucleic Acids Research,1990,18(15):4345-4354.

[5] Richard T Pon. A long chain biotin phosphoramidite reagent for the automated synthesis of 5′-biotinylated oligonucleotides[J].Tetrahedron Letters,1991,32(14):1715-1718.

[6] Al-Hakim A H, Hull R. Studies towards the development of chemically synthesized non-radioactive biotinylated nucleic acid hybridization probes[J].Nucleic Acids Research,1986,14(24):9965-9976.

[7] 閻汝連,張思騫. DNA合成用化學試劑-2-氰乙氧基-雙(N,N-二異丙基)亞磷酸胺的合成[J].化學試劑,1992,14(4):237-238.

[8] Germann M W, Pon R T, van de Sande J H. A general method for the purification of synthetic oligodeoxyribonucleotides containing strong secondary structure by reversed-phase high-performance liquid chromatography on PRP-1 resin[J].Analytical Biochemistry,1987,165:399-405.

[9] Alves A M, Holland D, Edge M D. A chemical method of labelling oligodeoxyribonucleotides with biotin:A single step procedure using a solid phase methodology[J].Tetrahedron Letters,1989,30(23):3089-3092.

[10] Paul S Nelson,Mark Kent. Sylvester muthini.Oligonucleotide labeling methods.3.Direct labeling of oligonucleotides employing a novel,non-nucleosidic,2-aminobutyl-1,3-propanediol backbone[J].Nucleic Acids Research,1992,20(23):6253-6259.

[11] Mitsuo Sekine, Kazuhisa Okada, Kohji Seio,etal. Synthesis of a biotin-conjugate of phosmidosineO-ethyl ester as a G1 arrest antitumor drug[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry,2004,12(24):6343-6349.