新型[1,2,4]三唑[4,3-b]均四嗪類化合物的合成及其抗癌活性

陳 輝, 鄭彩霞， 楊玉峰， 林婷婷， 袁 棟， 徐 峰

(臺州職業技術學院 生物與化學工程學院,浙江 臺州 318000)

均四嗪類化合物具有較多生理活性，如抗炎[1]、鎮痛[2]、抗病毒[3]及抗菌[4]。均四嗪的衍生物一般分為三類，即1,4-二氫，1,2-二氫和1,6-二氫均四嗪。近年來發現二氫均四嗪類化合物具有抗癌活性而引起人們關注。胡惟孝等[5]發現3，6-二苯基-1,4-二氫-1，4-二甲酰胺均四嗪類化合物具有很強的抗癌活性，其中N，N′-二間甲基苯胺-3，6-二甲基-1，4-二氫均四嗪-1，4-二甲酰胺對小鼠白血病細胞P-388,人實體瘤細胞肝癌BEL-7402，乳腺癌MCF-7和肺腺癌A-549均有較強的增殖生長抑制作用；饒國武等[6]發現3，6-二苯基-1，2-二氫均四嗪類化合物具有較強的抗癌活性,其中1-氯乙酸酰基-3，6-苯基-1，2-二氫均四嗪對P-388和A-549具有較強的抗癌能力。但至今為止，1，6-二氫均四嗪衍生物的抗癌活性研究還未見文獻報道。

Scheme1

本文以3-(3,5-二甲基吡唑-1-基)-6-肼基均四嗪(1)和芳醛(2a～2f)為原料，經Schiff堿縮合和環合反應合成了6個新型的6-芳基-3-(3,5-二甲基吡唑-1-基)[1,2,4]三唑[4,3-b]均四嗪(4a～4f， Scheme 1)，其結構經1H NMR， MS， IR和元素分析表征。以順鉑為對照，采用四氮唑鹽還原法(MTT法)測試了體外4a～4f對人白血病細胞株HL-60， A-549， MCF-7和人子宮頸癌細胞株Hela的抗癌活性。結果表明，4a～4f均具有較強的體外抗癌活性。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

XRC-1型熔點儀(溫度未經校正)；Brucker AC400(400 MHz)型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；Nicolex FI-IR-170型紅外光譜儀(KBr壓片);HP 5989A型質譜儀。

HL-60， A-549， MCF-7和Hela,中國科學院上海生命科學院細胞庫；DMEM培養基，Gibco； MTT， Sigma(上海實生細胞生物技術有限公司分裝)；胎牛血清，青霉素-鏈霉素，EDTA-胰酶消化液，Gibco；順鉑，齊魯制藥有限公司產品(產品批號1010011DC)；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 3a～3f的合成(以3a為例)

在反應瓶中加入1 1.0 g(4.85 mmol)的無水乙醇(20 mL)溶液，攪拌下于室溫滴加苯甲醛(2a)0．5 g(4.85 mmol)的無水乙醇(10 mL)溶液，滴畢，反應至終點(TLC跟蹤，展開劑：乙酸乙酯)。抽濾，濾餅干燥得磚紅色固體1-苯基亞甲基-2-[6-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基]肼(3a),產率，58.0%， m.p.198 ℃～200 ℃；1H NMRδ: 12.59(s, 1H), 8.37(s, 1H), 7.78(d,J=6.6 Hz， 2H), 7.44～7.49(m, 3H), 6.24(s, 1H), 2.47(s, 3H), 2.25(s, 3H)； IRν： 3 217, 3 053, 1 606, 1 485, 1 419 cm-1； MSm/z： 295{[M+H]+}。

用類似的方法合成3b～3f,其表征數據[7]與Scheme 1預期吻合。

(2)4a～4f的合成(以4a為例)

在反應瓶中加入3a1．5 g(4．5 mmol)和氯仿30 mL，攪拌下加入四醋酸鉛2.5 g(5.7 mmol)的氯仿(10 mL)溶液，回流反應30 min(溶液變成棕黃色)。冷卻至室溫，減壓抽除溶劑，加入無水乙醇，析出大量固體，冷卻至0 ℃，抽濾，濾餅干燥后用無水乙醇重結晶得深黃色固體3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-6-苯基-[1,2,4]三唑[4,3-b]均四嗪(4a)。

用類似的方法合成黃色固體4b～4d, 4f和棕黃色固體4e。

1．3 抗癌活性測試

以順鉑為對照，采用MTT法測定4a～4f對HL-60， A549， MCF-7和Hela的體外抗癌活性。順鉑和4(1 mg)用DMSO(20 μL)溶解；取2 μL用1 000 μL培養液稀釋，使濃度(c)為100 μg·mL-1,再用培養液連續稀釋至使用濃度;每1 000 mL培養基中含80萬單位青霉素，1.0 g鏈霉素,10%滅活胎牛血清;將腫瘤細胞接種于培養基中,置37 ℃, 5%CO2培養箱中培養，3 d～5 d傳代。

將癌細胞用EDTA-胰酶消化液消化，并用培養基稀釋成1.0×105·mL-1,加到96孔細胞培養板中，每孔100 μL，置37 ℃， 5%CO2培養箱中培養。接種24 h 后，傾去培養基，加入用培養基稀釋的樣品，每孔 200 μL，每個濃度加3孔，置37 ℃， 5%CO2培養箱中培養72 h后在細胞培養孔中加入5 mg·mL-1的MTT，每孔10 μL，置37 ℃孵育3 h;加入DMSO,每孔150 μL,用振蕩器振蕩，使甲臢完全溶解，用酶標儀于490 nm處測OD值,計算細胞生長抑制率{抑制率/%=[1-(OD藥物-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100%},根據細胞生長抑制率，以直線回歸方法計算IC50值。以同樣條件用不含樣品，含同樣濃度DMSO的培養基培養的細胞作為對照，計算樣品對腫瘤細胞生長的半數致死濃度(IC50)。

表1 4的實驗結果和MS數據Table 1 Experimental results and MS data of 4

表2 4的1H NMR和IR數據Table 2 1H NMR and IR data of 4

2 結果與討論

2．1 合成

合成4時，縮合劑可用四醋酸鉛，也可用甲磺酸和對甲苯磺酸等磺酸類催化劑，效果均較好。合成4的實驗結果和表征數據分別見表1和表2。從表1可見，當苯環上的取代基為吸電子基(2b～2d,2f)時，產物的顏色為亮黃色，且收率較高(56.5%～73.2%)；當苯環上的取代基為電子基(2e)或無取代基(2a)時，產物的顏色相對較深，收率也較低(31.3%～40.6%)， 4e還極易吸潮發黏。

2．2 抗癌活性

4的抗癌活性結果見表3。由表3可見，4a～4f對四種癌細胞均具有較強的抑制活性，其中4a對HL-60的活性(IC50=3.54 μg·mL-1)約為順鉑(IC50=6.65 μg·mL-1)的2倍； 4b抑制A-549的活性(IC50=2.70 μg·mL-1)與順鉑(IC50=2.62 μg·mL-1)相當；在抑制MCF-7時， 4a～4f的活性(IC50=1.09 μg·mL-1～6.36 μg·mL-1)明顯好于或相當于順鉑(IC50=6.38 μg·mL-1)；另外，4a～4f雖然顯示了較好的抑制Hela的活性(IC50=1.05 μg·mL-1～6.91 μg·mL-1)，但比順鉑(IC50=0.58 μg·mL-1)略顯遜色。

表3 4的抗癌活性Table 3 Anti-cancer activities of 4

[1] Lang J S A, Johnson B, Cohen L E,etal. Aryl-s-tetrazines with anti-inflammatory activity[J].J Med Chem,1976,19(12):1404-1409.

[2] Kigasawa K, Hiiragi M, Wagatsuma N,etal. Novel 1,2,4,5-tetrazine and method[P].JP 54 163 579,1979.

[3] Werbel L M, Mcnamara D J. Synthesis and antimalarial effects ofN,N-dialkyl-6-(substituted phenyl)-1,2,4,5-tetrazin-3-amines[J].J Heterocycl Chem,1979,16：881-894.

[4] Arthur K G, Howard B. Controlling bacterial infections using substituted symmetrical tetrazines[P].GB 1 245 443,1971.

[5] Hu W X, Rao G W, Sun Y Q. Synthesis and antitumor activity ofs-tetrazine derivatives[J].Bioorg Med Chem Let,2004,14:1177-1181.

[6] Rao G W， Hu W X. Synthesis,structure analysis,and antitumor activity 3,6-disubstituted-1,4-dihydro-1,2,4,5-tetrazine derivatives[J].Bioorg Med Chem Let,2006,12:3702-3705.

[7] 3b:絳紅色固體,產率42.1%， m.p.204 ℃～207 ℃；1H NMRδ: 12.60(s, 1H), 8.36(s, 1H), 7.84(q,J=8.8 Hz, 5.6 Hz， 2H), 7.32(t,J=8.8 Hz， 2H), 6.24(s, 1H), 2.50(s, 3H), 2.47(s, 3H)； IRν： 3 222, 3 036, 1 606, 1 572, 1 423 cm-1； MSm/z： 313({[M+H]+}． 3c：桔紅色固體,產率84.3%， m.p.229 ℃～230 ℃；1H NMRδ: 12.82(s, 1H), 8.69(s, 1H), 8.07(d,J=8.6 Hz， 1H), 7.75(s, 1H), 7.55(d,J=8.6 Hz， 1H), 6.24(s, 1H), 2.50(s, 3H), 2.25(s, 3H)； IRν： 3 222, 3 065, 1 573, 1 485, 1 421 cm-1； MSm/z： 363{[M+H]+}. 3d：鮮紅色固體，產率98.0%， m.p.220 ℃～222 ℃；1H NMRδ: 12.91(s, 1H), 8.45(s, 1H), 8.32(d,J=8.8 Hz， 2H), 8.04(d,J=8.8 Hz， 2H), 6.26(s, 1H), 2.50(s, 3H), 2.26(s, 3H)； IRν： 3 257, 3 022, 1 523, 1 485, 1 428 cm-1； MSm/z： 340{[M+H]+}. 3e:暗紅色固體,產率83.2%, m.p.198 ℃～200 ℃；1H NMRδ: 12.45(s, 1H), 8.31(s, 1H), 7.72(d,J=8.8 Hz， 2H), 7.04(d,J=8.8 Hz， 2H), 6.23(s, 1H), 3.82(s, 3H), 2.45(s, 3H), 2.25(s, 3H)； IRν： 3 230, 3 062, 1 513, 1 488, 1 424 cm-1； MSm/z： 325{[M+H]+}． 3f:桔黃色固體,產率90.4%. m.p.215 ℃～217 ℃；1H NMRδ: 12.77(s, 1H), 8.76(s, 1H), 8.07(d,J=9.6 Hz， 1H), 7.56(s,J=9.6 Hz， 1H), 7.46(m, 2H), 6.25(s, 1H), 2.51(s, 3H), 2.25(s, 3H)； IRν： 3 210, 3 055, 1 540, 1 458, 1 420 cm-1； MSm/z： 328{[M+H]+}.