N7-鳥嘌呤烷化物的合成及其在DNA損傷檢測中的應用

張 然, 許 潔, 趙麗嬌, 鐘儒剛

(北京工業大學 生命科學與生物工程學院,北京 100124)

堿基修飾是DNA損傷的一種重要形式。外源化學致癌物或者藥物進入生物體內后,與細胞內的DNA發生作用生成各種不同結構的堿基修飾產物,造成DNA分子結構和穩定性的變化,進而可能導致DNA斷鏈、交聯、堿基錯誤配對等損傷[1]。堿基的烷化修飾是DNA在親電試劑作用下生成的一種常見損傷產物,一些致癌物(如丁烯醛、亞硝胺)就是通過導致DNA堿基的烷化修飾而誘發癌癥的[2～4]。堿基烷化產物一般都形成于堿基的親核部位,其中鳥嘌呤的N7-位是親核位點中最活潑的。N7-鳥嘌呤烷化物是致癌或者抗癌過程中的重要分子標記物[5，6],其在動物體內的生成機理、分析檢測方法和體外制備方法是化學、藥學和毒理學領域的熱點問題。 比如,亞硝胺是一類重要的致癌物質,研究表明其在細胞色素P450作用下代謝活化生成α-羥基亞硝胺,然后經分解生成活潑親電試劑烷基重氮鹽離子,進而導致鳥嘌呤的烷化損傷[7，8]。一些藥物也能夠導致DNA堿基的烷化修飾,比如臨床上用于治療淋巴瘤的氮芥和用于治療腦瘤的亞硝基脲,均能夠導致鳥嘌呤烷化進而引起DNA交聯[9]。Osborne等[10]研究表明,N,N-2-氯乙基甲胺可誘導大馬哈魚睪丸DNA生成兩種N7-鳥嘌呤烷化物和以其為中間體的兩種交聯物。Bodell[11～13]報道氯乙基亞硝基脲和DNA反應能生成13種DNA損傷產物,其中包括堿基烷化修飾物N7-(2-羥乙基)鳥嘌呤(3a)和N7-(2-氯乙基)鳥嘌呤(3b),并且3a和3b的含量明顯高于其它烷化產物,說明鳥嘌呤N7-位最容易受到烷基重氮鹽離子的進攻。

13a～3e

Scheme1

本文以脫氧鳥苷(1)為原料,建立了3a,3b,N7-(2-溴乙基)鳥嘌呤(3c),N7-乙基鳥嘌呤(3d)和N7-烯丙基鳥嘌呤(3e)的合成方法(Scheme 1),其結構經UV,1H NMR, IR和MS確證。并以3a～3e為標準品,采用高效液相色譜質譜聯用法(HPLC-MS)對1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲(卡莫司汀)導致的鳥嘌呤烷化損傷產物進行了分析。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

BRUKER AC-P400型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內標);BRUKER VERTEX 70型傅里葉變換紅外光譜儀(KBr壓片);Thermo-Fisher TSQ Quantum型高效液相色譜-電噴霧質譜聯用儀(HPLC-MS)。

1,東京化學工業株式會社;小牛胸腺DNA(ctDNA),卡莫司汀、蛇毒磷酸二酯酶、乙腈、硫酸二乙酯,Sigma; 3-溴-1-丙烯(2e), Acros Organics; 1-溴-2-氯乙烷(2b), 1,2-二溴乙烷(2c),J & K CHEMICA;脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ), S1核酸酶和牛腸堿性磷酸酶(CIAP), TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;硅膠200目～ 300目;其余所用試劑均為分析純。

1.2 3的合成(以3a為例)

在圓底燒瓶中依次加入1101.4 mg(0.38 mmol),環氧乙烷(2a) 250 μL(4.94 mmol)和冰醋酸1 mL,攪拌下于37 ℃反應1 h。減壓蒸去溶劑后經硅膠柱層析[梯度洗脫劑: A=V(甲醇) ∶V(乙酸乙酯)=1 ∶20～1 ∶9]純化得白色固體3a54.9 mg。

用類似方法合成白色固體3b～3e。

3a: UVλmax: 240, 284 nm;1H NMRδ: 3.69～3.71(m, 2H, 11-H), 4.13～4.14(m, 2H, 10-H), 6.39(s, 2H, NH2), 8.09(s, 1H, 8-H); IRν: 3 489, 3 326, 2 960, 2 931, 2 873, 1 729, 1 656, 1 469, 1 447, 1 388, 1 123, 1 073 cm-1; ESI-MSm/z: 196.1{[M+H]+, 100%}。

3b[二甲亞砜(1 mL)為溶劑,梯度洗脫劑: A=1 ∶20～1 ∶10]: UVλmax: 246, 284 nm;1H NMRδ: 4.04～4.06(m, 2H, 11-H), 4.50～4.53(m, 2H, 10-H), 6.19(s, 2H, NH2), 7.98(s, 1H, 8-H), 10.89(s, 1H, NH); IRν: 3 326, 3 960, 2 932, 2 874, 1 733, 1 681, 1 469, 1 385, 1 281, 1 122, 1 074, 777 cm-1; ESI-MSm/z: 214.0{[M+H]+, 100%}, 216.1{[M+H]+, 33%}。

3c[二甲亞砜(1 mL)為溶劑,梯度洗脫劑: A=1 ∶20～1 ∶10]: UVλmax: 243, 285 nm;1H NMRδ: 3.17～3.18(m, 2H, 11-H), 3.34～3.36(m, 2H, 10-H), 6.13(s, 2H, NH2), 7.95(s, 1H, 8-H); IRν: 3 326, 3 170, 2 963, 2 934, 1 731, 1 683, 1 613, 1 472, 1 387, 1 288, 1 124, 1 076, 746, 699 cm-1; ESI-MSm/z: 258.0{[M+H]+, 100%}, 260.0{[M+H]+, 98%}。

3d[硫酸二甲酯200 mg(1.59 mmol),N,N-二甲基乙酰胺(1 mL)為溶劑,梯度洗脫劑: A=1 ∶20～1 ∶10]: UVλmax: 247, 283 nm;1H NMRδ: 2.52～2.55(m, 3H, 11-H), 4.05～4.16(m, 2H, 10-H), 6.81(s, 2H, NH2), 6.95(s, 1H, 8-H); IRν: 3 432, 3 317, 3 155, 2 922, 2 871, 1 691, 1 658, 1 560, 1 387, 1 267, 1 214, 1 014, 939 cm-1; ESI-MSm/z: 180.1{[M+H]+, 100%}。

3e[二甲亞砜(1 mL)為溶劑,梯度洗脫劑: A=1 ∶20～1 ∶9]: UVλmax: 247, 285 nm;1H NMRδ: 5.18～5.21(m, 2H, 12-H), 5.70～5.93(m, 1H, 11-H), 4.53～4.68(m, 2H, 10-H), 7.02(s, 2H, NH2), 8.03(s, 1H, 8-H); IRν: 3 429, 3 328, 3 165, 2 955, 2 922, 1 683, 1 640, 1 559, 1 476, 1 383, 1 207 cm-1; ESI-MSm/z: 192.1{[M+H]+, 100%}。

1.3 3在DNA損傷檢測中的應用

在反應瓶中依次加入1 mg·mL-1ctDNA溶液10 mL和二氯乙基亞硝基脲(BCNU) 2 mg，攪拌下于37 ℃避光反應12 h。取反應液0.2 mL，用無水乙醇(0.4 mL)析出ctDNA;離心分離，沉淀用75%乙醇漂洗兩次;加入Tris-HCl緩沖溶液0.2 mL制得與BCNU反應的ctDNA溶液。將ctDNA溶液于98 ℃熱變性5 min,迅速放入冰浴中冷卻10 min(使ctDNA雙鏈變性為單鏈)。依次加入DNaseⅠ 5 μL(300 U), S1核酸酶 5 μL(1000 U), S1核酸酶緩沖液(10 mmol·L-1NaOAc, 150 mmol·L-1NaCl, 0.05 mmol·L-1ZnSO4, pH 4.6) 20 μL,于37 ℃酸性酶解3 h。加入堿性磷酸酶(CIAP) 5 μL(150 U),蛇毒磷酸二酯酶10 μL (1U), CIAP緩沖液(500 mmol·L-1Tris HCl, 10 mmol·L-1MgCl2, pH=9.0) 50 μL, 于37 ℃堿性酶解3 h。用濃鹽酸調至pH 1.0,于95 ℃反應1 h(使脫氧核糖核酸脫糖)。酶解液經MicroconYM-10離心過濾，濾液即為含烷化物的樣品溶液。

HPLC測試條件:Thermo ODS C18反相柱(2.1×150 mm, 5 μm),柱溫25 ℃,檢測波長260 nm;流動相為2 mmol·L-1AcONH4水溶液(A)和乙腈(B)。洗脫梯度為:Q=V(B) ∶V(A)=5 ∶95, 0 min～5 min; Q=5 ∶95～15 ∶85, 5 min～20 min; Q=15 ∶85～20 ∶80, 20 min～22 min; Q=20 ∶80～5 ∶95, 22 min～23 min; Q=5 ∶95, 23 min～30 min。流速0.2 mL·min-1,進樣量25 μL。

采用選擇反應掃描(SRM)對DNA損傷產物進行檢測。

2 結果與討論

2.1 3的合成與純化

合成均在無水條件下進行,所用試劑需無水或進行無水處理。為了提高1的轉化率,所用烷化劑(2a～2e)均過量。在合成3a時,由于環氧乙烷(2a)的沸點為11 ℃,常溫下極易揮發,因此吸取轉移環氧乙烷的整個過程需要在冰箱中進行。曾參考文獻[14]方法合成3a，但未得到產物。本研究在文獻[14]方法的基礎上將反應溫度由100 ℃降至37 ℃,反應5 min左右HPLC-MS即檢測到3a的色譜峰;再每隔20 min取樣10 μL,用甲醇(1 mL)稀釋后經HPLC-MS檢測,比較3a色譜峰的峰面積,確定最佳反應時間為1 h。

在3c的合成中,隨反應時間的增長,會副產1-[N-(2-脫氧胞基)]-2-[N-(2-脫氧鳥基)]乙烷,從而降低產率,因此反應時間控制在48 h。經過對反應溫度的優化,合成3b和3c的最佳反應溫度為40 ℃。3a～3e均經硅膠柱層析純化,其中3a所用洗脫劑的極性略大,以便加快洗脫速度,得到的洗脫液中3a的含量較高,靜置后會有少量白色固體析出。

2.2 經BCNU處理的DNA中3的檢測

以3a～3e為標準品,選擇SRM掃描模式對BCNU-DNA酶解液進行HPLC-MS定性分析。對3a～3e分別監測離子通道m/z196→152,m/z214→152,m/z258→152,m/z192→152和m/z180→152。

在用HPLC-MS檢測BCNU處理的DNA溶液時，通道m/z196→152和m/z214→152的離子流圖中有明顯的譜峰，對應N7-(2-羥乙基)鳥嘌呤和N7-(2-氯乙基)鳥嘌呤,且出峰時間與標準品3a和3b的出峰時間一致,分別為3.23 min和11.75 min;除了這兩個峰以外,在6.06 min處還有一個峰,對應m/z196→152的離子碎裂方式,推測為O6-(2-羥乙基)鳥嘌呤。

以上結果表明,BCNU和ctDNA反應會導致N7-鳥嘌呤烷化,生成N7-(2-羥乙基)鳥嘌呤和N7-(2-氯乙基)鳥嘌呤。

本研究為進一步對鳥嘌呤N7-位烷化損傷的質譜定量分析提供了參考。

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