超聲輔助酶促己酸乙酯的合成

沈詠梅, 謝曉娜, 荀二娜, 王佳欣, 張 弘, 王 磊, 王 智

(1. 吉林大學 a. 白求恩醫科大學制藥廠; b. 分子酶學工程教育部重點實驗室; c. 第一臨床醫院,吉林 長春 130021)

酶在非水反應介質中的催化作用是近年來酶工程研究領域的熱點之一[1]。雖然酶在非水相中的催化反應具有許多優點，但在工業生產上的應用卻很有限，這主要是由于酶在非水反應介質中活力較低，尋找能加快酶促反應速度的方法迫在眉睫。近年來超聲技術在化學中得到迅速發展。在適宜的條件下超聲作用能極大地提高反應速度，而這種技術在酶促反應中的應用最近才開始得到關注[2]。酶是一種比較容易變性的蛋白質，微小的結構改變可能會極大地降低酶的催化活性，因此選擇合適的反應條件對超聲輔助的酶催化反應顯得尤為重要[3～6]。

己酸乙酯作為濃香型白酒的主體風味物質,是衡量白酒質量的重要指標之一[7],市場需求量很大。目前主要利用酸催化法[8]制備；但化學法制備的產品質量不高，同時酸催化還會產生大量廢液，造成環境污染。在前期研究工作中[9,10]，我們將來源于嗜熱性古細菌Aeropyum pernix K1的嗜熱脂肪酶APE1547固定在帆布上成功地催化制備了己酸乙酯。然而該方法合成速度較慢，反應周期較長。

本文以脂肪酶Bacillussubtilislipase(BSL2)在有機溶劑中催化合成己酸乙酯，重點考察了超聲條件對酶促合成反應的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津GC-14B型氣相色譜儀[GC, Econo-CAP SE54毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 mm),氫火焰檢測器;載氣N2(60 mL·min-1);進樣室溫度200 ℃,檢測室溫度290 ℃;升溫程序:起始柱溫110 ℃,保留1 min,升溫速率15 ℃·min-1,最后溫度210 ℃,保留2 min;進樣量2 μL]; KQ-250DE型臺式數控超聲波清洗器(最大功率250 W,功率可調40%～100%,水浴控溫20 ℃～80 ℃); AP-400/150 W型全數字超聲波處理器(功率150 W，探頭直徑3 mm)。

所用試劑均為分析純。

1.2 BSL2的制備[11]

將工程菌BSL按接種量的1%接種于硫酸卡那霉素的LB培養基(5 mL含有30 μg·mL-1)上,于30 ℃恒溫振蕩培養20 h。再將其按1%的接種量接種于LB培養基(200 mL)上,于30 ℃恒溫振蕩培養4 h;轉接到發酵LB培養基(2 L)上，于30 ℃恒溫培養，監測培養液的OD600值，當OD600達到0.8～1.0時，離心分離(8 000 rpm, 15 min),上清液(菌體)于-20 ℃冷凍過夜。取出于室溫自然融化，加入菌體9倍體積的50 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液(pH 8.5)和溶菌酶[V(菌體) ∶V(溶菌酶)=1 ∶500],于4 ℃恒溫消化1.0 h。離心分離(4 ℃, 12 000 rpm, 20 min),上清液即為BSL2粗酶。

BSL2粗酶加40%硫酸銨溶液析出沉淀，離心分離(8 000 rpm, 15 min);上清液用70%硫酸銨溶液沉淀,離心分離(8 000 rpm, 15 min);棄上清液，沉淀用TNS-HCl緩沖溶液溶解,置透析袋中透析過夜，凍干得無色粉末BSL2，備用。

1.3 初始水活度(aw)的控制

通過直接在基本反應體系中加入水合鹽控制aw。反應體系的aw分別為0.06(LiBr), 0.11(LiCl), 0.24(AcOK), 0.33(MaCl2), 0.53[Mg(NO3)2], 0.75(NaCl)和0.97(K2SO4)。

1.4 BSL2催化合成己酸乙酯

在反應瓶中依次加入正己烷(aw=0.53,硅藻土40 mg) 20 mL,120 mmol·L-1己酸和乙醇,BSL2 100 mg，置振蕩培養箱或超聲清洗器中于50 ℃反應20 min。GC測定己酸轉化率,并計算反應速度(μmol·g-1·min-1)。

2 結果與討論

2.1 反應裝置的影響

首先比較了超聲探頭和超聲波清洗器對酶促合成己酸乙酯的影響，結果見表1。從表1可以看出，利用超聲清洗器產生的超聲對反應具有明顯的促進作用，反應速度相對常規振蕩提高了約1.56倍；而利用超聲探頭產生的超聲則在相同反應條件下大幅度降低了酶活。分析其原因，很可能是超聲作用能夠促進底物和產物在反應體系中的擴散，增加底物與酶分子活性中心發生相互作用的幾率，從而大幅度提高反應速度；另外一定強度的超聲作用能夠改善酶的“微環境”，優化其空間構象[12]，因此進一步提高了其催化活性。與超聲波清洗器相比較，超聲探頭更容易與反應體系中的酶分子發生直接接觸，從而導致酶分子變性失活。而超聲清洗器產生的超聲則需要通過反應介質的傳導作用才能夠作用于酶分子上，因此其破壞作用大幅度減弱，所以超聲清洗器對酶促反應的促進效果比較理想。

表 1 反應裝置對酶促合成己酸乙酯的影響*Table 1 Effect of reaction apparatus on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase

*反應速度(μmol·g-1·min-1)定義：BSL2 1 g在1 min催化合成己酸乙酯的量(μmol);常規振蕩:150 rpm, 50 ℃;超聲水浴:連續超聲,150 W, 50 ℃; 超聲探頭:探頭離反應液液面1 cm,連續超聲,150 W, 50 ℃

2.2 超聲方式的影響

在相同的反應條件下，考察了超聲處理方式對酶促合成己酸乙酯的影響，結果見表2。從表2可以看出，相對常規振蕩，連續超聲和間歇超聲作用都明顯提高了反應速度;其中間歇超聲更有利于促進反應，在間歇超聲(50 s/30 s)的作用下，反應速度提高了3.9倍。連續超聲很可能對酶分子的空間構象造成了一定的破壞，因此連續超聲的作用效果并不十分理想。而超聲預處理之所以不能大幅度提高酶活，其原因很可能是它不能促進底物和產物在反應體系中的擴散，導致底物與酶分子活性中心發生相互作用的幾率仍然較低的緣故。

表 2 超聲方式對酶促合成己酸乙酯的影響*Table 2 Effect of ultrasonic ways on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase

*超聲預處理:將含有BSL2 100 mg的正己烷(20 mL, aw=0.53,硅藻土40 mg)置超聲清洗器中進行預處理(連續超聲,150 W, 50 ℃, 20 min),加底物反應;間歇超聲:在超聲清洗器中反應，超聲50 s,間歇30 s(150 W, 50 ℃,總反應時間20 min)

2.3 間歇超聲時間的影響

固定間歇時間30 s,在超聲清洗器中于50 ℃反應20 min,其余反應條件同1.4,考察超聲時間對酶促合成己酸乙酯的影響,結果見圖1。由圖1可見，間歇時間固定以后，反應速度隨著超聲時間的延長大幅度提高;超聲時間為50 s時達到最大;進一步延長超聲時間，反應速度開始下降。

固定超聲時間50 s,在超聲清洗器中于50 ℃反應20 min,其余反應條件同1.4,考察間歇時間對酶促酯合成己酸乙酯的影響,結果見圖2。從圖2可以看出，隨著間歇時間的延長，反應速度同樣呈現出先上升后下降的趨勢，最適間歇時間為30 s。這可能是如果間歇時間太短，酶分子的空間構象容易受到超聲作用的破壞，間歇時間越短，這種破壞程度越大。然而一旦間歇時間過長，超聲促進底物和產物在反應體系中的擴散效果就會大幅度減弱，因此對酶促合成己酸乙酯反應的作用效果也不是十分理想。

Ultrasonic time/s圖 1 超聲時間對酶促合成己酸乙酯的影響*Figure 1 Effect of ultrasonic time on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*固定間歇時間30 s,在超聲清洗器中于50 ℃反應20 min,其余反應條件同1.4

Intermission time/s圖 2 間歇時間對酶促合成己酸乙酯的影響*Figure 2 Effect of intermission time on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*固定超聲時間50 s,其余同圖1

2.4 超聲功率的選擇

間歇超聲50 s/30 s,考察超聲功率對酶促合成己酸乙酯的影響,結果見圖3。由圖3可見，當超聲功率為150 W時反應速度最快，升高或降低超聲功率都會降低超聲作用的效果。很明顯不同強度的超聲對酶蛋白的影響效果是不同的，合適強度的超聲有可能改變甚至優化酶分子的空間構象，從而提高酶的催化活性；而高強度的超聲則有可能破壞酶的構象，導致酶分子的變性失活。

Ultrasound power/W圖 3 超聲功率對酶促合成己酸乙酯的影響*Figure 3 Effect of ultrasound power on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*間歇超聲50 s/30 s,其余同圖1

2.5 反應溫度的影響

間歇超聲50 s/30 s,其余反應條件同1.4,考察反應溫度對酶促合成己酸乙酯的影響,結果見圖4。由圖4可見，在超聲作用下，酶分子對反應溫度似乎變得更加敏感，溫度的微小波動導致酶活大幅度改變，這與Gennaro[13]的研究結果一致。當反應溫度為50 ℃時，反應速度最快。其原因可能是超聲的“空化作用”在較高溫度下更容易發生，當超聲“空化作用”太劇烈的時候就會直接破壞酶分子的空間構象，甚至直接破壞酶蛋白內部某些化學鍵，從而容易引發酶蛋白的變性失活。

Temperature/℃圖 4 反應溫度對酶促合成己酸乙酯的影響*Figure 4 Effect of reaction temperature on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*間歇超聲50 s/30 s,其余同圖1

2.6 aw的影響

在含有微量水的有機介質中，水分子可以直接或間接地通過氫鍵、疏水鍵及范德華力等非共價鍵相互作用來維持酶的催化活性所必需的構象，因此在非水反應介質中水對酶催化反應的影響是非常巨大的[14]。

aw圖 5 初始水活度(aw)對酶促合成己酸乙酯的影響*Figure 5 Effect of initial water activity on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*間歇超聲50 s/30 s,其余同圖1

間歇超聲50 s/30 s,其余反應條件同1.4，考察aw對酶促合成己酸乙酯的影響，結果見圖5。從圖5可以看出，aw對反應速度的影響呈典型的“鐘”形曲線，當aw為0.53時，反應速度最快。

綜上所述，酶促合成己酸乙酯的最佳反應條件為：正己烷20 mL(硅藻土40 mg, aw=0.53), 120 mmol·L-1己酸和乙醇，BSL2 100 mg,在超聲(150 W)清洗器中采用間歇超聲50 s/30 s，于50 ℃反應20 min，反應速度31.95 μmol·g-1·min-1(常規振蕩法的反應速率8.18 μmol·g-1·min-1)。

3 結論

在超聲輔助酶促己酸乙酯合成反應的研究中，考察了超聲發生裝置、超聲處理方法，超聲功率、超聲溫度以及初始水活度等反應條件對酶活的影響。在最適反應條件下，脂肪酶BSL2催化合成己酸乙酯的反應速率相對常規振蕩提高了3.9倍。

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