固定化嗜熱酯酶催化拆分(R,S)-2-甲基-1-丁醇

張 弘, 李雅微, 曹淑桂, 程鐵欣, 王 智, 王 磊

(1. 吉林大學 a. 分子酶學工程教育部重點實驗室; b. 化學學院; c. 生命科學學院,吉林 長春 130023)

(S)-2-甲基-1-丁醇(4)是一種具高附加值的精細化工產品，是合成手性化合物特別是手性液晶材料的重要中間體[1]，并可用于增塑劑、粘合劑、除草劑及香料的合成[2]，應用前景廣泛。獲得4的主要途徑是從雜醇油(發酵酒精蒸餾過程的副產物)中分離，但存在分離困難、光學純度及化學純度低等缺點[3]。近年來生物催化逐漸受到重視，并顯現出極大的優越性，特別是有機相酶催化的應用使4的酶法拆分合成更具有實用性。文獻[4]方法利用水解酶對(R,S)-2-甲基-丁醇(1)進行拆分制備高光學活性的4，但是存在選擇性差、催化效率低等缺點。本研究小組[5]已經成功地利用嗜熱酯酶APE1547拆分1，

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Scheme1

但由于游離酶的穩定性及重復利用性較差，實際應用受到極大限制。固定化酶技術則可以很好地解決這個問題，固定化酶不但具有酶的催化特性，又具有一般化學催化劑能回收、反復使用等優點，更適合工業化生產的需要。本研究小組[6]曾報道以纖維素為主要成分的帆布作為固定化載體制備固定化酶APE1547(3)，并將其應用于己酸乙酯的合成，取得了良好的效果。

本文利用3催化轉酯化反應進行酶促拆分1制備4(Scheme 1)。并探討了反應溶劑,酰基供體(2a～2e),反應溫度,底物配比等對3催化活力(EA3/μmol·min-1·mg-1)與4對映選擇性比率(E4)的影響，同時考察了3的重復使用性能。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

島津UV-2550型和UV-1700型紫外分光光度計;Aglient 6890型氣相色譜儀[氫離子火焰檢測器,ASTEK ChiraldexTM G-TA(γ-cyclodextrin, trifluoroacetyl) capillary column(30 m×0.25 mm),載氣He， 25 mL·min-1，進樣室溫度200 ℃，檢測室溫度290 ℃，升溫程序：起始柱溫50 ℃，保留5 min，程序升溫10 ℃·min-1，終止溫度180 ℃，保留10 min]。

嗜熱酯酶APE1547(干粉)，吉林大學分子酶學工程教育部重點實驗室自行克隆、表達[7]；1及乙酸乙烯酯(2a),上海試劑一廠;丙酸乙烯酯(2b),丁酸乙烯酯(2c),戊酸乙烯酯(2d)及己酸乙烯酯(2e), Fluka公司;3按文獻[6]方法制備,蛋白載量[9]為350 mg·g-1;其余所用試劑均為分析純。

1.2 3催化1的拆分

在反應瓶中依次加入11 mmol,2a～2d4 mmol, 溶劑2 mL和3(蛋白含量5 mg),在設定溫度下反應5 h。

1.3 3的重復使用性能

在最佳反應條件下反應5 h，離心分離(3 000 r·min-1, 5 min)回收3，在同樣反應條件下進行下一輪反應。

1.4 EA3, 1轉化率及E4的測定

EA3定義為反應初始半小時內1 mg酶1 min酰化1的摩爾量。

取1.3的反應產物0.2 μL作GC分析，基線分離得到4(t4=24.9 min)與5(t5=25.6 min)，根據1峰面積的減少計算其轉化率(c1)，根據4與5峰面積的比值確定4的光學純度(ee4),并由下式計算E4。

2 結果與討論

2.1 拆分條件選擇

(1) 溶劑

非水酶學研究中溶劑是影響酶促拆分反應的一個重要因素，很多研究[8]報道通過改變溶劑可以調控酶分子的催化活性及立體選擇性。本文以不同疏水性(LgP)的有機溶劑作反應介質，考察溶劑對轉酯化酶促拆分反應的影響，結果見表1。由表1可見，隨著LgP的降低，3的催化活性逐漸下降，這與Laane等[9]提出的LgP原則一致。原因是LgP大的溶劑會奪取酶分子中維持其活性構象的“結構水”導致酶活力下降，但與其他常溫酶相比，3中存在大量的鹽橋及氫鍵，使其具有較強的耐受有機溶劑的能力[10]，因此在LgP較高的時候，3依然表現出一定的活力，而不是徹底失活；以正己烷為溶劑時，EA3和E4最高，這可能是由于正己烷的分子性質與3立體選擇性催化所需環境接近的原因。

表 1 溶劑對3催化拆分1的影響*Table 1 Effect of solvent on resolution of 1 catalyzed by 3

*EA3:3的催化活力;E4:4的對映選擇性比率; 拆分條件:11 mmol,2c4 mmol,3(蛋白質含量) 5 mg, 溶劑2 mL,于65 ℃拆分反應5 h

(2) 酰基供體

作為一種常用的非水酶催化體系，用脂肪酸乙烯酯作為酰化試劑進行醇類物質的動力學拆分研究較多[11]。與其它酰化試劑相比，脂肪酸乙烯酯具有明顯的優點，利用脂肪酸乙烯酯為酰基供體時，酶催化的拆分反應成為不可逆反應，反應速度更快，酶的選擇性較高。

本文選用五種不同脂肪酸鏈長的酰基供體2a～2e用于酶促拆分，考察酰基供體碳鏈長度對EA3和E4的影響，結果見表2。從表2可以看出，隨著2碳鏈的延長，EA3逐漸下降，這是由于2的鏈長度增加，其進入酶分子活性中心的難度也逐漸增大，所以導致EA3下降。

通常水解酶在催化轉酯反應過程中，首先與酰基供體形成酰基-酶復合體，該復合體再與具有親核基團的底物分子(本文中為1)進行反應，立體選擇性產生的原因應該分別出現在酰基酶復合體與底物手性醇的結合或反應過程中。

表 2 酰基供體對3催化拆分1的影響*Table 2 Effect of acyl donors on resolution of 1 catalyzed by 3

*正己烷2 mL,其余拆分條件同表1

從表2還可以看出，2碳鏈長度的微小改變都極大地改變E4，當酰基供體為2c時，E4最佳，再增長碳鏈，E4反而下降。綜合考慮EA3及E4，2c是較為適宜的酰基供體。

(3) 溫度

溫度是影響酶促拆分反應的重要因素之一，溫度通過影響酶的三維結構進而影響酶的催化活性和立體選擇擇。本文考察不同溫度對3催化拆分1的EA3及E4的影響，結果見圖1。從圖1可以看出，當反應溫度從35 ℃到75 ℃逐漸升高時，EA3隨之顯著升高;并在65 ℃達到最大值；溫度繼續升高則EA3大幅降低。一方面，3只有在較高的溫度下才能得到最佳催化構象從而表現出高活性；另一原因則是反應溫度升高后加快了反應體系中分子之間的運動，增加酶分子和底物的碰撞機率，從而縮短反應時間，提高反應效率。E4隨著反應溫度的升高也呈現先升高后降低的趨勢，且最佳催化溫度要比其他常用酶的最適溫度高，這與我們[12]以往發現的嗜熱酯酶催化反應的規律一致。因此65 ℃為最適拆分溫度。

Temperature/℃圖 1 溫度對3催化拆分1的EA3及E4的影響*Figure 1 Effect of reaction temperature on EA3 and E4 of resolution of 1 catalyzed by 3*正己烷2 mL,其余拆分條件同表1

(4) 底物比率

轉酯化反應是雙分子底物反應，且酶催化反應的速率取決于酶與底物的結合速率，因此底物比率r[n(2c) ∶n(1)]的變化會對反應產生巨大影響，但醇濃度過高會導致酶變性失活，因此在本研究中保持3與1用量不變的情況下，研究r從1 ∶1變化到6 ∶1對酶促拆分反應的影響，結果見圖2。由圖2可見，E4基本不受r的影響;EA3則隨著r的升高而逐漸增加。r大于4 ∶1時，EA3增加幅度不大，因此選擇r=4 ∶1。

r圖 2 r對3催化拆分1的EA3及E4的影響*Figure 2 Effect of r on EA3 and E4 of resolution of 1 catalyzed by 3*r=n(2c) ∶n(1); 正己烷2 mL,其余拆分條件同表1

綜上所述，最佳酶促拆分條件為:11 mmol,2c4 mmol,3(蛋白質含量) 5 mg,正己烷2 mL,于65 ℃拆分反應5 h。在最佳拆分條件下EA3=0.53 μmol·min-1·mg-1，E4=15.4。

Reused times圖 3 在3催化拆分1時3的重復使用性能*Figure 3 Reuse of 3 in resolution of 1 catalyzed by 3*正己烷2 mL,其余拆分條件同表1

2.2 3的重復使用

3催化拆分1制備4時，考察了3的重復使用性能(重復使用12次)，結果見圖3。由圖3可見，3重復使用8次后EA3仍然較高，其相對活力在最初活力的85%以上。E4在重復利用8次后也仍然保持在一個較高的水平，良好的重復利用性使3有望應用于4的大規模生產。

3 結論

利用帆布固定化嗜熱酯酶APE1547催化轉酯化反應拆分2-甲基-1-丁醇，通過條件優化得到酶促拆分(R,S)-2-甲基-1-丁醇制備(S)-2-甲基-1-丁醇的最佳條件。在最優條件下，EA3=0.53 μmol·mg-1·min-1，E=15.40。同時固定化酶在重復利用8次后仍然表現出極好的催化性能，顯示出該酶在(S)-2-甲基-1-丁醇的大規模生產中具有潛在的應用價值。

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