殼聚糖希夫堿金屬[Cu(Ⅱ), Mn(Ⅱ)]配合物的合成及其抑菌活性

劉正華, 樂學義, 陳 實, 周曉華, 范 玲

(1. 華南農業大學 理學院 生物材料研究所,廣東 廣州 510642; 2. 中山市小欖農產品質量檢驗檢測中心,廣東 中山 528415)

在食品生產經營中違法添加有毒有害防腐劑已成為影響食品安全的突出問題之一,因此開發高效、無毒、環境友好型食品防腐劑勢在必行。殼聚糖(CTS)具有無毒、生物相容性好、可降解和抗菌活性等特點，是開發天然防腐抗菌劑的理想材料[1～8]。但CTS本身的水溶性和抗菌效果比較弱，達不到食品生產經營中防腐保鮮的要求,通過化學改性方法提高其水溶性和抗菌活性是解決這一問題的關鍵。

Scheme1

本文擬通過化學改性的方法將水楊醛引入CTS中，并與人體必需的微量金屬元素Cu(Ⅱ), Mn(Ⅱ)配位，大大提高其溶解性和抗菌活性，為CTS類防腐劑的分子設計和應用進行了有益的探索，為制備高效無毒、綠色的天然殼聚糖基食品防腐劑提供了一種新的思路。

CTS的氨基與水楊醛發生反應制得殼聚糖希夫堿配體(L); L與銅鹽、錳鹽發生配位反應制得殼聚糖希夫堿Cu(Ⅱ)， Mn(Ⅱ)配合物(1和2, Scheme 1)，其結構經UV, IR和熒光光譜表征。L的酚亞胺的N原子和酚羥基的O原子同時參與配位。初步抑菌活性測試結果表明，1和2對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌和枯草桿菌的抗菌活性較L和金屬鹽均有明顯提高。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

Shimadzu UV-2550型紫外光譜儀;AVATAR 360 FT-IR型紅外光譜儀(KBr壓片);Nicolet RF-5301PC型熒光光譜儀;DTG-60型差熱熱重儀。

CTS, DD 88.1%,含量98.9%,山東奧康生物科技有限公司;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草桿菌，廣州微生物研究所;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) L的合成

在反應瓶中依次加入1%冰乙酸40 mL和CTS 1.00 g，攪拌使其完全溶解(透明溶液)，減壓過濾;攪拌下依次向濾液中緩慢加入無水乙醇50 mL和水楊醛2 mL，回流(75 ℃)反應8 h(淡黃色黏稠沉淀)。冷卻至室溫，減壓過濾，濾餅用95%乙醇反復洗滌至洗出液中無水楊醛(UV檢測λ=325 nm)。于-30 ℃真空冷凍干燥24 h得淡黃色粉末L。

(2) 1和2的合成

在反應瓶中依次加入水楊醛4 mL的無水乙醇(60 mL)溶液和CuCl2·2H2O 1.9 g,攪拌使其完全溶解，減壓過濾制得溶液A。

在反應瓶中依次加入蒸餾水50 mL和CTS 2.00 g，攪拌使其完全溶解，減壓過濾，攪拌下依次向濾液中緩慢加入無水乙醇30 mL和溶液A，攪拌3 min～5 min,回流(75 ℃)反應8 h。冷卻至室溫，用5%NaOH溶液調至pH 4(析出大量淡綠色沉淀)，減壓過濾，濾餅用蒸餾水洗滌3次～4次，再用無水乙醇反復洗滌至洗出液中無水楊醛，同時用0.1 mol·L-1Na2S溶液檢測洗出液中無黑褐色沉淀為止。于-30 ℃真空冷凍干燥24 h得淡綠色粉末1。

以MnCl2·4H2O代替CuCl2·2H2O,用類似方法(于75 ℃反應12 h。冷卻至室溫，用5%NaOH溶液調至pH 5.2)制得淡粉色粉末2。

2 結果與討論

2.1 配合物的IR分析

CTS, L, 1和2的IR分析結果見表1。由表1可見，CTS在1 658 cm-1處的吸收峰對應C=O的反對稱伸縮振動，在1 595 cm-1處的吸收峰對應N-H的變形振動。L在這兩處的吸收峰消失，而在1 630 cm-1處出現了C=N反對稱伸縮振動吸收峰，這是希夫堿酚亞胺的特征吸收；在1 580 cm-1, 1 498 cm-1和1 461 cm-1處出現苯環骨架振動特征吸收；在1 276 cm-1處出現酚羥基C-O彎曲振動吸收峰；指紋區752 cm-1處的銳峰為鄰位取代苯的特征吸收峰。1和2的酚亞胺吸收峰分別紅移至1 612 cm-1處和1 630 cm-1處，且吸收明顯減弱；1的酚羥基C-O彎曲振動吸收幾乎消失；2的酚羥基C-O彎曲振動吸收蘭移至1 277 cm-1且吸收明顯減弱[10]，說明C=N鍵中的氮原子和酚羥基上的氧原子同時參與了配位；而且1和2中苯環鄰取代的特征峰及苯環的骨架振動特征峰相對L都出現不同程度的位移，這表明Cu(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)均與L形成了配合物。

表 1 CTS, L, 1和2的IR數據Table 1 IR data of CTS, L, 1 and 2

2.2 配合物的UV分析

CTS, L, 1和2的UV譜圖見圖1。從圖1可以看出,CTS只在202 nm處有1個強而窄的吸收峰，在大于210 nm區域無明顯吸收。L有三個明顯的吸收峰，在324 nm處的吸收峰為酚亞胺C=N的吸收，歸屬于n→π*躍遷形成的R帶吸收峰，其特點是躍遷幾率小，吸收強度弱；255 nm處的吸收峰為芳香類化合物特有的B帶吸收帶，吸收強度中等；210 nm是酚亞胺C=N產生π→π*躍遷形成的K帶吸收峰，特點是吸收強度大。

λ/nm圖 1 CTS, L, 1和2的UV譜圖Figure 1 UV spectra of CTS, L, 1 and 2

L的特征吸收峰在1和2配合物中仍然存在，表明形成配合物后C=N雙鍵未被破壞，但均有不同程度的紅移，酚亞胺的R帶吸收峰分別紅移至335 nm和333 nm， K帶吸收峰分別紅移至218 nm和224m，各吸收峰的吸光強度也發生了不同程度的變化，顯示N→Cu(Ⅱ)鍵和N→Mn(Ⅱ)鍵的形成，這是由于C=N的N原子參與了配位，破壞了分子的有序性，從而使躍遷能級減小，吸收光譜發生了紅移，表明C=N的N原子參與了配位。這些結果與IR分析吻合。

2.3 配合物的熒光分析

CTS, L, 1和2的熒光光譜數據見表2。從表2可以看出，CTS, L, 1和2的最大激發波長(λex)在228.8 nm～230.1 nm，變化不大，但相對CTS和L而言，1和2的激發光譜強度有所增強，這可能是金屬離子參與配位后化合物共價性增強所致。相對CTS而言，L的最大發射波長(λem)發生了紅移。λem與物質結構中的有效共軛程度有關，有效共軛程度越高，λem越大，表明CTS經水楊醛化學改性后的L中形成了許多酚亞胺C=N鍵，使整個分子結構的效共軛程度上升。這也充分證明水楊醛在CTS上接枝成功，生成了如Scheme 1預期的L。1和2的熒光光譜比較相似，說明它們的結構特征相似。由于CuCl2·2H2O和MnCl2·4H2O分別與L反應形成1和2后，分子電子云密度發生變化，平面度增加，π電子的共軛度增強，因而其λem與L相比均發生紅移，發光強度也明顯提高，這證實1和2的結構與Scheme 1預期一致。這些分析結果均與IR和UV一致。

表 2 CTS, L, 1和2的熒光光譜數據Table 2 Fluorescence data of CTS, L, 1 and 2

綜合IR, UV和熒光光譜分析結果，表明水楊醛與CTS的接枝產物為殼聚糖希夫堿L; L與CuCl2·2H2O和MnCl2·4H2O反應生成殼聚糖希夫堿金屬配合物時，C=N參與了配位。

2.4 配合物的熱重分析

CTS, L, 1和2的主要熱重數據見表3。CTS在100.00 ℃以下失去吸附水，在258.39 ℃～371.29 ℃失重90.339%，主要是CTS降解所致[10]。L的失重溫度范圍和失重比率相對CTS基本不變，即L在276.82 ℃～375.97 ℃降解，失重89.615%。1和2的熱行為比較相似，100 ℃以下的失重顯示配合物中結晶水的失去。相對而言， 1的開始分解溫度比CTS和L低，可能是由于L與銅配位后，其分子內的氫鍵結合被破壞，結晶度發生改變，熱穩定性減小所致[11]。而2的開始分解溫度比CTS和L稍高，顯示L與金屬錳離子配位后，熱穩定性有所改變。配合物的最終產物為相應的金屬氧化物CuO和MnO。1的熱分解殘留率34.01%(EDTA絡合滴定法測定CuO 31.71%);2的熱分解殘留率22.10%(MnO 21.51%),可見殘留率與配合物中金屬氧化物含量的測定值基本吻合。

表 3 CTS, L, 1和2的TGA數據Table 3 TGA data of CTS, L, 1 and 2

2.5 配合物的抑菌活性

培養基為水解酪蛋白胨肉湯，待測樣品均用1%HCl溶液配制。抗菌活性實驗采用試管稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)[9]，實驗結果見圖2。由圖2可見，(1)1和2的最小抑菌濃度明顯小于相關對照; (2)對于同一種細菌而言，1和2的抗菌活性雖然有一定不同，但統計結果顯示沒有顯著差異; (3) 對于同一種配合物而言，抗菌活性對不同的菌種表現也不盡相同，1對大腸桿菌的MIC≤700 μg·mL-1，對沙門氏菌的MIC≤1 200 μg·mL-1。2對枯草桿菌的MIC≤2 400 μg·mL-1，對金黃色葡萄球菌的MIC≤900 μg·mL-1，總體來說，配合物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制作用更為明顯。L與Cu(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)形成配合物后，均能對四種細菌產生抗菌活性，而且抗菌活性相對L得到提高，可能是因為L與金屬離子形成配合物后，其細胞滲透性相對較高，容易阻止或抑制細菌生長[13]；同時由于生物體內金屬離子容易與氧結合，能夠儲存、轉移、甚至進入特定的生物狀態，影響蛋白質、氨基酸、輔酶及脂蛋白的合成，并與蛋白質的某些成份形成穩定的配合物，使蛋白質或酶變性[14，15]，從而對細菌起到了一定的抑制作用。雖然殼聚糖希夫堿配合物的抗菌機理仍有待于進一步探討，但從實驗結果可以看出這類配合物在抑菌、防腐等方面具有很大的潛在應用價值。

圖 2 化合物的抑菌活性*Figure 2 Antibacterial activities of compounds

*E.coli:大腸桿菌,B.subtilis:金黃色葡萄球菌,SE:沙門氏菌,SA:枯草桿菌;數據統計通過SPSS11.5 軟件處理，a, b, c, d, e表示數據之間的差別等級(置信度P=0.95,α=0.05),其中a～e表示數據由大到小，不同字母表示結果之間有顯著差異，相同字母表示結果之間無顯著差異

[1] 王科兵,王芳宇. 殼聚糖及其衍生物抗菌作用的研究進展[J].臨床軍醫雜志,2007,35(6):937-939.

[2] 孫海香,宋保強,夏枚生,等. 不同相對分子質量的殼聚糖對大腸桿菌K88的抑菌作用[J].中國畜牧雜志,2005,41(7):30-31.

[3] Issam S T, Adele M G, Adele C P,etal. Chitosan polyer as bioactive coating and film against aspergillus niger contamination[J].Journal of Food Science,2005,70(2):100-104.

[4] 吳小勇,曾慶孝,阮征,等. 殼聚糖的抑菌機理及抗菌特性研究進展[J].中國食品添加劑,2004,6:46-49.

[5] Holappa J, Nevalainen T, Soininen P,etal. Synthesis of novel quaternary chitosan derivatives viaN-chloroacyl-6-O-triphenylmethylchitosans[J].Biomacromolecules,2006,7:407-410.

[6] Babu V R, Hosamani K M, Aminabhavi T M. Preparation and invitro release of chlorothiazide novel pH-sensitive chitosan-N,N′-dimethylacrylamide semi-interpenetrating network microspheres[J].Carbohydrate Polymers,2008,71:208-217.

[7] Mourya V K, Inamdar N N. Chitosan-modifications and applications:Opportunities galore[J].Reactive & Functional Polymers,2008,68:1013-1015.

[8] Rabea E I, Badawy M E I, Steurbaut W,etal. In Vitro assessment ofN-(benzyl)chitosan derivatives against some plant pathogenic bacteria and fungi[J].European Polymer Journal,2009,45:237-245.

[9] Andrews J M. Determination of minimum inhibitory concentrations[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2001,48(Suppl.1):5-16.

[10] Sun W, Xia C G, Wang A Q. Cyclopropanation of styrene catalyzed by chitosan Schiff base copper(Ⅰ) heterogeneous catalyst[J].Acta Chimica Sinica,2002,60(1):162.

[11] Fahd A A Tirkistani. Thermal analysis of some chitosan schiff bases[J].Polymer Degradation and Stability,1998,60(1):67-70.

[12] José E dos S, Edward R D, éder T G C. Synthesis and characterization of Schiff bases from chitosan and salicylaldehyde derivatives[J].Carbohydrate Polymers,2005,60(3):277-282.

[13] Rajeev J, Gajendra K, Dharmendra K,etal. Synthesis and antibacterial activity of M(Ⅱ) Schiff base complex[J].Journal of Indian Council of Chemists,2009,26(1):23-27.

[14] Gaur S. Phsicochemical and biological properties of Mn(Ⅱ),Co(Ⅱ),Ni(Ⅱ) and Cu(Ⅱ) chelates of Schiff bases[J].Asian Journal of Chemistry,2003,15(1):250-254.

[15] Mishra D K, Mishra A P. Synthesis,structural characterization and biological significance of some nevel schiff-base complexes with Co(Ⅱ),Ni(Ⅱ) and Cu(Ⅱ)[J].International Journal of Pharmaceutical Research & Development,2011,3(5):24- 31.