20(S)-O-取代苯甲酸-7-乙基喜樹堿酯類化合物的合成及其抗腫瘤活性

高 鵬， 朱 磊， 王佳樂， 王浦海， 孫 立， 袁勝濤

(1. 南京工業大學 a. 藥學院； b. 江蘇省藥物研究所，江蘇 南京 211816； 2. 中國藥科大學 國家南京新藥篩選中心，江蘇 南京 211009)

喜樹堿(1)是由Wall等[1]于1966年首次從珙桐科植物喜樹中分離得到的一種具有很強抗腫瘤活性的生物堿。構效關系研究表明[2～4]，1分子中E環內酯環結構的完整性與其抗腫瘤活性密切相關，其內酯結構是抑制拓撲異構酶Ⅰ(Topo Ⅰ)的重要基團。1在體內存在著閉環的內酯形式和開環的羧酸鹽形式之間的平衡，而在生理pH條件下，1極易由內酯環形式開環為羧酸鹽形式。人血漿白蛋白優先與1的羧酸鹽形式結合，形成穩定的復合物，使平衡向開環的羧酸鹽形式移動，導致體內具有抗腫瘤活性的內酯環含量很低，毒副作用增大。1分子中存在1個分子內氫鍵，它不僅活化了內酯環也削弱了羥基和酶的相互作用[5，6]。如果將1的20-位羥基酯化，勢必消除1分子內氫鍵，增加鄰近羰基的位阻，降低羰基的活性，使親核試劑不易進攻羰基，從而可減緩內酯環在體內的開環，有利1發揮抗腫瘤作用。

研究發現[7，8]，在1的7-位引入親脂性基團可以提高其脂溶性，增加穩定性，延長藥物在體內代謝時間，從而減少給藥量，降低藥物對人體的傷害，增加抗腫瘤活性。Tanizawa等[9]發現7-乙基在穩定喜樹堿衍生物與DNA-TopoⅠ復合物的相互反應中起著重要的作用。我們設想將1的20-位羥基酯化和7-位乙基化同時引入喜樹堿衍生物中，以期使兩者的協同作用來進一步增加療效，降低毒副作用。

本文以1和正丙醛為原料，在冰醋酸-硫酸體系中以H2O2-FeSO4為自由基引發劑經自由基烷基化反應制得7-乙基喜樹堿(2)[10]；以1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)為脫水劑，2在DMAP催化下與取代苯甲酸(3a～3k)直接酯化[11]，合成了11個新型的20(S)-O-取代苯甲酸-7-乙基喜樹堿酯類化合物(4a～4k， Scheme 1)，其結構經1H NMR， IR和ESI-MS表征。初步測定了4a～4k對人肺癌細胞(LLC-E9FP)，人肺腺癌細胞(95D)，人胃癌細胞(BGC-803)，人胃癌細胞(HGC-27)和人肝癌細胞(7721)的增殖抑制活性。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

X-4型數字顯示顯微熔點儀(溫度未校正)；AVANED AV-500型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內標)；Nicolet IS 10型傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；Waters Q-TOF MicroTM型質譜儀；EssentiaLC-15C型高效液相色譜儀[Luna十八烷基硅膠柱，流動相：V(甲醇) ∶V(水)=80 ∶20， 267 nm)。

CompabcdefghijkR1HHHHHHNO2NO2HHCF3R2HFClBrINO2HHCNCF3HR3HHHHHHHNO2HHH

Scheme1

1，成都瀾綺制藥有限公司；EDCI和DMAP，蘇州昊帆生物科技有限公司；其余所用試劑均為分析純，其中CH2Cl2經CaH2回流干燥處理，丙醛用前重蒸。

1.2 合成

(1)2的合成

將13.00 g(8.6 mmol)溶于冰醋酸(80 mL)中，于5 ℃～10 ℃緩慢滴加98%硫酸20 mL，滴畢，攪拌至亮黃色得溶液A。

在三口燒瓶中加入FeSO4·7H2O 2.50 g(9 mmol)和去離子100 mL，攪拌使其溶解；于2 ℃左右加入溶液A，攪拌均勻后滴加正丙醛3.00 mL(40 mmol)，滴畢，待體系溫度降至2 ℃左右時緩慢滴加30%H2O22.40 mL(15 min);反應45 min。傾入250 mL冰水中，靜置1.0 h，過濾，濾液用氯仿(3×100 mL)萃取，合并萃取液，減壓濃縮至干得黃色固體。經硅膠(100目～200目)柱層析(洗脫劑:氯仿)純化得淡黃色粉末22.40 g，純度99.0%(HPLC，下同)，收率74.0%， m.p.259 ℃～260 ℃(259 ℃～261 ℃[12])；1H NMRδ: 1.04(t,J=7.3 Hz, 3H, 19-CH3), 1.42(t,J=7.5 Hz, 3H, 30-CH3), 1.88(m, 2H, 18-CH2), 3.22(q, 2H, 29-CH2), 3.80(s, 1H, 20-OH), 5.29(s, 2H, 5-CH2), 5.30(d,J=16.6 Hz, 1H, 17-CH2), 5.75(d,J=16.6 Hz, 1H, 17-CH2), 7.68(t,J=7.5 Hz, 1H, 10-CH), 7.71(s, 1H, 14-CH), 7.81(t,J=7.5 Hz, 1H, 11-CH), 8.13(d,J=8.5 Hz, 1H, 9-CH), 8.26(d,J=8.5 Hz, 1H, 12-CH)； IRν： 3 373, 1 757, 1 658, 1 607, 1 155 cm-1。

(2) 4的合成(以4a為例)

在三口燒瓶中加入苯甲酸(3a)0.73 g(6 mmol)的CH2Cl2(100 mL)溶液，冰浴(2 ℃)冷卻下攪拌均勻；依次加入20.75 g(2 mmol)， EDCI 1.53 g(8 mmol)及DMAP 1.47 g(12 mmol)，避光攪拌15 min。拆去冰浴，升至室溫，避光反應2.0 h(淡黃色澄清溶液)。傾入100 mL冰水中洗滌，分液，有機層依次用稀酸(pH=3.3)，飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，減壓濃縮至1/10體積后經硅膠柱層析[梯度洗脫劑：V(CH2Cl2) ∶V(THF)=100 ∶0～95 ∶5]純化得類白色粉末，用CH2Cl2/MeOH重結晶得4a0.62 g，純度99.0%，收率64.4%。

用類似的方法合成4b～4k。

1.3 抗腫瘤活性測試[13，14]

取處于指數生長期狀態良好的細胞一瓶，加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細胞脫落，計數(2～4)×104個·mL-1，制成細胞懸液。取細胞懸液接種于96孔板上，180 μL/孔，置恒溫CO2培養箱中培養24 h。換液，加入受試藥物，20 μL/孔，培養72 h。將MTT試劑加入96孔板中，20 μL/孔，培養箱中反應4 h。吸去上清液，加入DMSO， 150 μL/孔，平板搖床上振搖5 min。用酶聯免疫檢測儀在波長為570 nm處測定每孔的吸光值(OD)，重復試驗3次取平均值計算腫瘤細胞抑制率{抑制率=[(OD對照-OD藥敏)/OD對照]×100%}。

2 結果與討論

2．1 合成

在2的合成中，1溶解性差，需在冰醋酸中加入98%硫酸助溶，提供H+與喹啉環上的氮原子結合形成銨鹽，增強1的溶解性，最佳的比例為V(冰醋酸) ∶V(濃硫酸)=4 ∶1，即能形成均相溶液又不至于酸過量引發大量副反應。H2O2作為親核試劑進攻醛基，在FeSO4·7H2O的引發和H2O2存在下生成酰基自由基，H2O2過量易引發副反應，FeSO4·7H2O過量則使最終產物顏色加深，最佳的n(FeSO4·7H2O) ∶n(H2O2)=3 ∶1。

在4的合成中，考慮到該反應的空間位阻，采取了亞胺催化進行縮合。先采用二環己基碳二亞胺(DCC)/DMAP體系，發現整個反應的進程很緩慢，平均反應時間在12 h以上，推測可能是DCC的亞胺兩端所連基團位阻較大不易與苯甲酸的羥基結合所致。改用位阻較小的EDCI后，反應速率明顯提高。使用催化量的DMAP時，反應產率不高(25%)且時間長(6 h左右)，當增加DMAP用量時反應明顯加快且收率提高，當n(2) ∶n(3) ∶n(EDCI) ∶n(DMAP) =1 ∶3 ∶4 ∶6時，反應基本在2 h左右完成且收率穩定(>65%)；同時，實驗還發現3上的基團對反應收率亦有影響，當苯甲酸上的取代基為強吸電子基團時，苯甲酸與EDCI形成中間態的羰基正電性增強有利于2的20-位羥基的親核取代的發生，如-NO2， -CF3存在時總收率能達到80%以上。

合成4的實驗結果見表1，表征數據見表2。

表1 合成4的實驗結果Table1 Experimental results of synthesizing 4

表2 4的1H NMR和IR數據Table 2 1H NMR and IR data of 4

續表2

Comp.1H NMR δ(J/Hz)IR ν/cm-14h1.13(t, J=7.5, 3H, 19-H), 1.40(t, J=7.8, 3H, 30-H), 2.39～2.53(m, 2H, 18-H), 3.21(q, 2H, 29-H), 5.29(s, 2H, 5-H), 5.49(d, J=17.0, 1H, 17-H), 5.79(d, J=17.0, 1H, 17-H), 7.22(s, 1H, 14-H), 7.65(t, J=9.8, 1H, 10-H), 7.75(q, 1H, 11-H), 8.10(t, J=9.8, 2H, 9,12-H), 8.40(d, J=7.5, 1H, 24-H), 8.46(m, 1H, 26-H), 8.93(s, 1H, 28-H)3 166, 2 972, 2 942, 2 881, 1 772, 1 742, 1 661, 1 605, 1 544, 1 345, 1 277, 1 165, 1 077, 762, 7204i1.10(t, J=7.5, 3H, 19-H), 1.40(t, J=7.8, 3H, 30-H), 2.33～2.45(m, 2H, 18-H), 3.20(q, 2H, 29-H), 5.24(d, J=17.0, 1H, 5-H), 5.28(d, J=17.0, 1H, 5-H), 5.47(d, J=17.0, 1H, 17-H), 5.78(d, J=17.0, 1H, 17-H), 7.22(s, 1H, 14-H), 7.67(t, J=7.8, 1H, 10-H), 7.78(t, J=8.0, 3H, 11,25,27-H), 8.11～8.20(m, 4H, 9,12,24,28-H)3 604, 2 978, 2 940, 2 880, 2 231, 1 757, 1 734, 1 667, 1 618, 1 453, 1 277, 1 155, 1 102, 858, 765, 7084j1.10(t, J=7.5, 3H, 19-H), 1.40(t, J=7.8, 3H, 30-H), 2.34～2.47(m, 2H, 18-H), 3.21(q, 2H, 29-H), 5.24(d, J=18.5, 1H, 5-H), 5.29(d, J=19.0, 1H, 5-H), 5.47(d, J=17.0, 1H, 17-H), 5.78(d, J=17.0, 1H, 17-H), 7.26(s, 1H, 14-H), 7.64(t, J=7.5, 1H, 10-H), 7.78(q, 3H, 11,25,27-H), 8.14(q, 2H, 9,12-H), 8.22(d, J=8.0, 2H, 24,28-H)2 975, 2 938, 2 882, 1 760, 1 732, 1 665, 1 613, 1 326, 1 276, 1 160, 1 130, 1 100, 1 065, 860, 766, 7034k1.09(t, J=7.5, 3H, 19-H), 1.40(t, J=7.8, 3H, 30-H), 2.35～2.49(m, 2H, 18-H), 3.20(q, 2H, 29-H), 5.24(d, J=18.5, 1H, 5-H), 5.29(d, J=19.0, 1H, 5-H), 5.47(d, J=17.0, 1H, 17-H), 5.78(d, J=17.0, 1H, 17-H), 7.26(s, 1H, 14-H), 7.62～7.79(m, 2H,10,25-H), 7.77(t, J=8.0, 1H, 11-H), 7.88(d, J=7.5, 1H, 26-H), 8.12(d, J=8.0, 1H,9-H), 8.16(d, J=8.5, 1H, 24-H), 8.29(d, J=8.0, 1H, 12-H), 8.36(s, 1H, 28-H)3 499, 2 980, 2 941, 2 882, 1 763, 1 729, 1 664, 1 613, 1 454, 1 337, 1 254, 1 122, 1 070, 975, 825, 759, 696

2.2 抗腫瘤活性

4的抗腫瘤活性結果見表3。由表3可見，4b和4e對LLC-E9EP的抑制率都超過了喜樹堿母核；4h， 4j和4k對95D也有明顯的抑制作用(抑制率分別為55.03%， 49.09%和48.51%)；但4a～4k對BGC-803的抑制作用較弱；對HGC-27， 4j有比較明顯的抑制作用(抑制率48.12%)；4d,4h和4k對7721有較為明顯的抑制活性(抑制率分別為45.98%, 44.99%和49.13%)。

由體外活性篩選的初步結果可以看出：喜樹堿的7-位乙基化和20-位取代苯甲酸酯化對喜樹堿抗腫瘤活性的提升起了積極作用；同時可以推測此類化合物的活性差異可能是由取代苯甲酸的取代基決定：當取代基為強吸電子基團時表現為較好的抗腫瘤活性；當取代基為鹵素時對LLC-E9FP抗腫瘤活性明顯增強；沒有取代基時大多無活性。由于此類化合物具有較好的體外抗腫瘤活性，其體內抗腫瘤活性實驗正在進行中。

表3 4對腫瘤細胞的抑制率*Table 3 Inhibition rates of 4to cancer cells

*c=1．0×10-6mol·L-1； LLC-E9FP：人肺癌細胞； 95D：人肺腺癌細胞； BGC-803：人胃癌細胞； HGC-27：人胃癌細胞； 7721：人肝癌細胞

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