補(bǔ)腎促排卵顆粒劑對(duì)高雄激素所致抑孕小鼠促排卵的影響*

杜汴興，于喜樂(lè)

(1．中國(guó)平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院，河南 平頂山467000;2．河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450000)

不孕不育的治療是維持生殖健康的一個(gè)重要方面。排卵障礙性不孕的比例約占不孕癥的20%～25%。引起排卵障礙性不孕的原因主要有中樞神經(jīng)性無(wú)排卵、下丘腦性無(wú)排卵、垂體性無(wú)排卵、卵巢性無(wú)排卵、多囊卵巢綜合征和卵巢黃素化不破裂綜合征等。對(duì)于本病的研究，無(wú)論是中醫(yī)學(xué)還是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，均取得了一定的進(jìn)展。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療排卵障礙性不孕的方法主要是服用促排卵藥物，但其產(chǎn)生的副作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。中醫(yī)藥的治療具有廉、便、效、驗(yàn)的特點(diǎn)，且有較少毒副作用。本課題是以筆者多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而出的腎—子宮生理生殖軸理論為指導(dǎo)，通過(guò)觀察補(bǔ)腎促排卵顆粒劑對(duì)高雄激素所致的抑孕小鼠促排卵的影響，探討其作用機(jī)制，從而為臨床運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng) 物

昆明種雌性小鼠，20 日齡，體質(zhì)量18～22 g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào):SCKX(豫)2005－0001。

1．2 藥品、試劑與儀器

補(bǔ)腎促排卵顆粒劑由丹參、合歡皮、熟地黃、茺蔚子、川牛膝、川續(xù)斷、五靈脂、紅花等藥物組成，由河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院顆粒劑藥房提供，為廣東一方制藥有限公司產(chǎn)品。將顆粒劑用蒸餾水溶解，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩ｈ鄞崧让追夷z囊，上海衡山藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)H31021107，用時(shí)將膠囊內(nèi)容物制成混懸液;丙酸睪丸酮注射液，上海通用藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)090302。SP9003 免疫組化試劑盒，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)40480459。婦科內(nèi)分泌酶聯(lián)免疫測(cè)定藥盒(批號(hào)31180013)及儀器(Access 型號(hào))，由美國(guó)Beekman－coulter 公司提供。DF110 型電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品;LDZ－52 型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品;BX60 型Olypus 顯微攝影系統(tǒng)，產(chǎn)地日本。

1．3 動(dòng)物分組與模型的建立

將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分層分為6 組，每組16 只。正常對(duì)照組16 只，頸背皮下注射生理鹽水;余下80 只造模，參照俞瑾［1］的頸背皮下注射丙酸睪丸酮的方法:將80 只小鼠頸背皮下注射0．06 mL 丙酸睪丸酮，每4 d 1 次，連續(xù)注射2 周，停藥1 周。將造模后的小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、枸椽酸氯米芬膠囊組和補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組。均分籠喂養(yǎng)，每組2 籠，自然光照，室溫17～20 ℃，濕度50%～70%，喂以顆粒飼料，自由飲水。

1．4 給藥方法

補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組依次給以8．33，4．11，2．08 g/kg 補(bǔ)腎促排卵顆粒劑顆粒混懸液，枸椽酸氯米芬膠囊組給以16．67 μg/g 枸椽酸氯米芬膠囊混懸液，分別按小鼠體質(zhì)量(0．02 mL/g)、組別灌胃給藥，每日1 次。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組按體質(zhì)量給以等容積生理鹽水。連用4 周后，停藥48 h，每組處死8 只，另余8 只做受孕率實(shí)驗(yàn)。因部分標(biāo)本組織處理不當(dāng)，故各組測(cè)試樣品數(shù)量不同。

1．5 檢測(cè)指標(biāo)

1．5．1 血清雌二醇(E2)

停止灌胃48 h，小鼠眼眶取血，分離血清，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)E2(送檢)。

1．5．2 卵巢、子宮臟器指數(shù)

處死小鼠，剖開(kāi)腹腔，切取子宮和卵巢，剝離周圍脂肪組織，迅速以扭力天平稱濕質(zhì)量，并按公式計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100。1．5．3 卵巢組織形態(tài)學(xué)

卵巢取出后，經(jīng)100 g 甲醛固定，組織切片經(jīng)HE 染色及油紅O 染色處理后，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1．5．4 雌激素受體(ER)

采用免疫組化法檢測(cè)。子宮取出后，經(jīng)100 g/L甲醛固定，組織切片石蠟包埋，4 μm 切片，雌激素受體標(biāo)記，蘇木素復(fù)染后光鏡觀察。

1．5．5 各組小鼠用藥后雌雄合籠受孕情況

將每籠8 只小鼠內(nèi)放入2 只正常成熟雄性小鼠，合籠10 d 后，解剖子宮，觀察其受孕情況。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13．0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()± 標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0．05 為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組小鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)對(duì)比

與模型對(duì)照組對(duì)比，補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大、中劑量組的卵巢指數(shù)和大、中劑量組的子宮指數(shù)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05 或P＜0．01);而補(bǔ)腎促排卵顆粒劑小劑量組、枸椽酸氯米芬膠囊組與模型對(duì)照組比較，子宮指數(shù)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)對(duì)比 x－ ±s

2．2 各組小鼠血清中E2 含量對(duì)比

模型對(duì)照組E2含量與正常對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。用藥后枸椽酸氯米芬膠囊組與模型對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大、中劑量與模型對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01);但補(bǔ)腎促排卵顆粒劑小劑量組，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。說(shuō)明補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大、中劑量對(duì)造模小鼠的雌激素水平有使其恢復(fù)正常的作用，且程度接近枸椽酸氯米芬膠囊組。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清中E2 含量對(duì)比 ±s

表2 各組小鼠血清中E2 含量對(duì)比 ±s

注:與正常對(duì)照組對(duì)比，* P ＜0．05;與模型對(duì)照組對(duì)比，# P ＜0．05，## P ＜0．01。

組 別 動(dòng)物數(shù) E2/(μg·L －1)9．83 ±2．86模型對(duì)照組 7 6．29 ±1．80*枸椽酸氯米芬膠囊組 6 13．50 ±5．08#補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大劑量組 7 15．75 ±2．94##補(bǔ)腎促排卵顆粒劑中劑量組 6 17．50 ±4．02#補(bǔ)腎促排卵顆粒劑小劑量組正常對(duì)照組6 8．83 ±2．86 6

2．3 各組小鼠卵泡數(shù)量、卵細(xì)胞數(shù)量、間質(zhì)腺成分及ER 表達(dá)率對(duì)比

鏡下觀察結(jié)果顯示:模型對(duì)照組可見(jiàn)大量原始竇狀卵泡，卵細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，卵泡直徑小，內(nèi)含大量漿液性物質(zhì)，生長(zhǎng)卵泡數(shù)目較少，黃體數(shù)量少。正常對(duì)照組可見(jiàn)各期卵泡及黃體組織。補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組均可使卵巢的黃體數(shù)量增加，間質(zhì)腺發(fā)達(dá)，促進(jìn)卵泡的發(fā)育、排卵及黃體生成。其中補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組接近于正常組，而枸椽酸氯米芬膠囊組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)黃體，間質(zhì)腺成分比例明顯低于補(bǔ)腎促排卵顆粒各組。

補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組卵細(xì)胞數(shù)、卵泡數(shù)量與模型對(duì)照組對(duì)比，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，與正常對(duì)照組接近。而ER 表達(dá)率補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組、枸椽酸氯米芬膠囊組與模型對(duì)照組比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。見(jiàn)表3。

從本實(shí)驗(yàn)可以看出:造模對(duì)間質(zhì)的影響不明顯，枸椽酸氯米芬膠囊組用藥后對(duì)間質(zhì)腺體的影響不大，而補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥后間質(zhì)腺體的水平高于正常對(duì)照組。這也從一個(gè)側(cè)面說(shuō)明:補(bǔ)腎促排卵顆粒劑是通過(guò)整體調(diào)節(jié)生殖器官的功能發(fā)揮作用，而不是單一對(duì)卵泡的刺激。

表3 各組小鼠卵泡數(shù)量、卵細(xì)胞數(shù)量、間質(zhì)腺成分及ER 表達(dá)率對(duì)比 ±s

表3 各組小鼠卵泡數(shù)量、卵細(xì)胞數(shù)量、間質(zhì)腺成分及ER 表達(dá)率對(duì)比 ±s

注:與正常對(duì)照組對(duì)比，* P ＜0．05，＊＊ P ＜0．01;與模型對(duì)照組對(duì)比，# P ＜0．01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 卵泡數(shù)量/個(gè) 卵細(xì)胞數(shù)量/個(gè) 間質(zhì)腺成分 ER 表達(dá)率/%正常對(duì)照組12．5 ±2．0 12．5 ±2．0 25．00 ±7．01 34．17 ±5．34模型對(duì)照組 6 9．2 ±2．1 2．4 ±0．7 45．00 ±9．88 60．00 ±9．13＊＊枸椽酸氯米芬膠囊組 6 34．3 ±5．9## 6．2 ±1．6# 21．67 ±4．80 11．17 ±3．44##補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大劑量組 6 28．4 ±3．6## 5．4 ±1．4## 31．67 ±1．00* 33．30 ±5．04##補(bǔ)腎促排卵顆粒劑中劑量組 6 21．7 ±3．8## 5．1 ±1．1## 45．83 ±6．52* 16．00 ±6．06#補(bǔ)腎促排卵顆粒劑小劑量組 6 23．2 ±2．6## 5．4 ±1．3## 36．76 ±5．53* 29．60 ±3．77 6#

2．4 各組小鼠受孕情況對(duì)比

補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大劑量組的妊娠率與枸椽酸氯米芬膠囊組、正常對(duì)照組相當(dāng)，說(shuō)明補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大劑量組與枸椽酸氯米芬膠囊組一樣可以恢復(fù)造模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生理功能。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠受孕情況對(duì)比

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為:腎藏精，為天癸之源，司生殖，精卵藏之于腎，所以腎為生殖之本。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為:卵子生成于卵巢，卵泡卵子是卵巢的主要組成部分，卵泡的發(fā)育、卵子的成熟、排卵的順利，均有賴于雌激素水平不斷提高［2］。因此，雌激素與卵泡、卵子的關(guān)系類乎于腎陰、癸水、與精的密切關(guān)系，即中醫(yī)學(xué)的腎－天癸－沖任－胞宮與下丘腦－垂體－卵巢環(huán)路相應(yīng)。故本實(shí)驗(yàn)用以補(bǔ)腎活血通絡(luò)為原則組方的促排卵顆粒劑調(diào)節(jié)卵巢功能，促發(fā)排卵實(shí)驗(yàn)，從而為中醫(yī)藥治療排卵功能障礙性不孕癥提供新思路。

3．1 補(bǔ)腎促排卵顆粒對(duì)子宮、卵巢的影響

本研究顯示:補(bǔ)腎促排卵顆粒劑使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物卵巢、子宮質(zhì)量增加，并增加卵丘及卵泡、黃體的數(shù)量，使間質(zhì)腺發(fā)達(dá)，促進(jìn)卵泡的發(fā)育，且大劑量組和中劑量組作用明顯。補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組卵細(xì)胞數(shù)、卵泡數(shù)與模型對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與正常對(duì)照組接近。對(duì)E2的影響:補(bǔ)腎促排卵顆粒劑可以提高模型對(duì)照組小鼠血中的E2水平，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)整性腺軸的功能，從而促使造模動(dòng)物恢復(fù)排卵功能。從此實(shí)驗(yàn)看，補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大劑量組的效果要優(yōu)于小劑量組。

3．2 補(bǔ)腎促排卵顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物子宮內(nèi)膜ER 的影響

補(bǔ)腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組、枸椽酸氯米芬膠囊組的ER 表達(dá)率與模型對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥組均優(yōu)于枸椽酸氯米芬膠囊組。雌激素受體是雌激素發(fā)揮作用的橋梁。如果E2水平低，會(huì)導(dǎo)致ER 合成障礙。子宮內(nèi)膜的功能也可以反映受精卵著床的情況，排卵前雌激素水平作為孕激素參與胚泡著床是不可少的。只有腺上皮ER 在圍著床期下降、滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜才能使孕激素支持著床，也只有當(dāng)腺上皮ER、PR 表達(dá)量明顯降低，內(nèi)膜處于可容受狀態(tài)，才是胚胎著床的最佳時(shí)機(jī)。由于子宮內(nèi)膜的功能也可以反映受精卵著床的情況，其中生殖器官的發(fā)育依賴于激素的作用，子宮是雌激素的靶器官，雌激素能增進(jìn)子宮血液的運(yùn)行，促進(jìn)其平滑肌細(xì)胞增生、肥大。雌激素的生理作用是由雌激素受體介導(dǎo)的拼體激素對(duì)子宮靶器官的效應(yīng)。雌激素的生物學(xué)效應(yīng)應(yīng)取決于雌激素水平ER 的含量，以ER 數(shù)為指標(biāo)可以判定藥物的激素活性。

3．3 展 望

人工輔助生殖技術(shù)的發(fā)展對(duì)促排卵治療提出了更高的要求。隨著對(duì)排卵機(jī)制和卵巢周期調(diào)節(jié)機(jī)制的深入了解，促排卵方法在不斷地改進(jìn)，可仍有許多不盡人意之處，如可出現(xiàn)卵巢過(guò)度刺激癥候群、卵巢反應(yīng)不良、多胎妊娠、自然流產(chǎn)、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等［3－6］。傳統(tǒng)的中醫(yī)藥的安全性與有效性，在治療排卵障礙性不孕癥得到了醫(yī)者的重視，同時(shí)在輔助生殖技術(shù)的前后使用中醫(yī)藥進(jìn)行調(diào)理，也使其成功率得到提高。在治療方面，眾多有關(guān)補(bǔ)腎藥的研究表明:補(bǔ)腎中藥具有明顯的調(diào)經(jīng)和促排卵作用，其強(qiáng)度可增加50%～100%，可提高排卵細(xì)胞質(zhì)量和卵裂能力，且是以增加正常卵細(xì)胞和卵裂細(xì)胞為主，對(duì)卵細(xì)胞質(zhì)量和卵裂過(guò)程不產(chǎn)生異常影響［7］。本研究從雌激素水平、雌激素受體、卵巢組織形態(tài)學(xué)角度，證明了補(bǔ)腎促排卵顆粒劑對(duì)下丘腦－垂體－卵巢軸的功能的影響，對(duì)臨床上運(yùn)用該方治療排卵障礙性不孕提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，作出了有意義的探索。在今后的工作與研究中可從分子生物學(xué)、藥物指紋學(xué)等多學(xué)科探討中醫(yī)藥治療排卵障礙性不孕癥的機(jī)制，更好地發(fā)揮中醫(yī)藥在治療該病中的優(yōu)勢(shì)。

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