NO/NOS 和T-AOC/LPO 在氣虛血瘀型萎縮性胃炎中的表達及益氣活血中藥干預(yù)作用的研究*

成映霞，段永強，楊曉軼，朱立鳴，張 虹

(1．甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)課部，甘肅 蘭州730020;2．甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州730020)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)的發(fā)生機制主要為多種因素誘發(fā)胃黏液、胃黏膜屏障防御減弱，胃動力障礙，自由基交聯(lián)損傷，最終導(dǎo)致細胞的不典型性、異常分化和黏膜結(jié)構(gòu)紊亂。其中自由基在細胞內(nèi)大量堆積，損傷生物大分子，特別是通過脂質(zhì)過氧化損傷生物膜，使膜通透性增加，導(dǎo)致細胞功能障礙甚至細胞崩解。有研究［1］表明:自由基損傷在胃黏膜炎癥、萎縮病變中具有重要的誘導(dǎo)作用。益氣活血中藥治萎防變膠囊是基于臨床效方而研制的療效確切的醫(yī)院制劑之一，主治氣虛血瘀型CAG。本研究旨在通過實驗研究治萎防變膠囊對CAG 大鼠胃黏膜一氧化氮(NO)/一氧化氮合酶(NOS)、總抗氧化能力(T-AOC )/過氧化脂質(zhì)(LPO)表達水平的影響，進一步探討該制劑防治CAG 的作用機制。

1 材料與方法

1．1 動 物

采用Wistar 大鼠90 只，SPF 級，體質(zhì)量(180 ±20)g，雌雄各半，標(biāo)準飼料喂養(yǎng)，均由甘肅中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心提供，動物合格證號:SCXK (甘)2004－0006－0000202。

1．2 藥品、試劑與儀器

治萎防變膠囊由人參、枳實、白術(shù)、半夏、白花蛇舌草、三七等藥物組成，0．4 g / 粒，為甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號061208;維酶素，0．2 g / 片，山東魯北藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號060407;鹽酸雷尼替丁膠囊，江西匯仁藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號0611025?？捡R斯亮蘭蛋白測定試劑盒(批號20071119，20051029 )、T-AOC 測 試 盒(批 號20071204)、LPO 測試盒(批號20071204)、NO 測試盒(批號20051122)、NOS 測試盒(批號20051120)，均由南京建成醫(yī)學(xué)生物研究所提供;甲基硝基亞硝基胍(MNNG)，F(xiàn)luka 公司產(chǎn)品，批號68051。DF 110 型電子分析天平，常熟市衡器廠產(chǎn)品;721 型可見光分光光度計，北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品;XYJ 80－2 離心機，江蘇響水縣醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;HH－4數(shù)顯恒溫水浴箱，鄭州杜甫儀器廠產(chǎn)品。

1．3 分組、模型的建立與給藥

除空白對照組10 只大鼠正常飼養(yǎng)不予造模外，其余大鼠建立氣虛血瘀型CAG 模型，方法參照文獻［2－3］改進:①以滅菌水配制0．1 g/L 甲基硝基亞硝基胍溶液，給大鼠自由飲用(避光)，1 d 配制1 次。②采用饑飽失常喂養(yǎng)法:足量喂養(yǎng)2 d ，禁食1 d 。③給以鹽酸雷尼替丁膠囊0．03 g/kg 灌胃，1 d 1 次。綜合造模60 d 后，每隔1 周殺檢大鼠，取胃黏膜做病理檢查判定腸化生的情況，至第12 周，大鼠胃黏膜腸化生形成后開始治療。

造模成功后將CAG 大鼠按體質(zhì)量編號，用隨機數(shù)字表法分為模型對照組，益氣活血中藥大、中、小劑量組，維酶素組，每組9 只，雌雄各半分籠飼養(yǎng)。益氣活血中藥大、中、小劑量組分別予0．6，0．3 ，0．15 g/(kg·d)益氣活血中藥灌胃(分別相當(dāng)于60 kg 成人每日劑量的10，5，2．5 倍)。維酶素組給予0．25 g/(kg·d)維酶素灌胃(相當(dāng)于60 kg 成人每日劑量的5 倍)，等效劑量按人與動物體型系數(shù)折算［4］，給藥容積均為0．01 mL/g 體質(zhì)量?？瞻讓φ战M、模型對照組給予同體積蒸餾水灌胃。各組均灌胃給藥90 d。

1．4 檢測指標(biāo)

各組動物于末次灌胃給藥后，禁食不禁水24 h，測體質(zhì)量并記錄后，斷頭處死大鼠。胃黏膜組織勻漿制備:低溫條件下快速剖取胃黏膜組織，以冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱質(zhì)量后用眼科小剪刀盡快剪碎，置于勻漿器中，用組織重9 倍生理鹽水勻漿(勻漿器的末端置于放冰塊的冷水中)，以3500 r/min離心10 min，取上清液置4 ℃冰箱保存，采用比色法檢測NO/NOS 及T-AOC/LPO。

1．5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13．0 統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標(biāo)準差(s)表示，組間樣本均數(shù)差異的比較選用F檢驗，在F檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義時，進一步用q檢驗進行兩兩比較。以P＜0．05 為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組大鼠胃黏膜NO 和NOS 水平對比

與空白對照組對比，模型對照組大鼠胃黏膜組織NO 和NOS 水平升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01，P＜0．05)。與模型對照組對比，益氣活血中藥各劑量組胃黏膜組織NO/NOS 水平降低，其中大劑量組此兩指標(biāo)較之差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05);維酶素組NO 水平與模型對照組對比，差別亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。見表1。

表1 各組大鼠胃黏膜NO 和NOS 水平對比 ±s

表1 各組大鼠胃黏膜NO 和NOS 水平對比 ±s

注:與空白對照組對比，* P ＜0．05，＊＊ P ＜0．01;與模型對照組對比，# P ＜0．05。

組 別 動物數(shù) 劑量/(g·kg －1) NO/(μmol·g prot －1) NOS/(U·mg prot －1)6．84 ±1．37 2．12 ±0．54模型對照組 9 — 8．78 ±1．65＊＊ 2．82 ±0．73*益氣活血中藥大劑量 9 0．60 7．19 ±1．21# 2．25 ±0．57#益氣活血中藥中劑量 9 0．30 7．89 ±1．59 2．36 ±0．65益氣活血中藥小劑量 9 0．15 8．19 ±1．78 2．41 ±0．50維酶素組 9 0．25 7．28 ±1．15#空白對照組 9 —2．40 ±0．51

2．2 各組大鼠胃黏膜T-AOC 和LPO 水平對比

與空白對照組對比，模型對照組大鼠胃組織TAOC 水平降低、LPO 水平升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)。與模型對照組對比，益氣活血中藥各劑量組T-AOC 水平升高、LPO 水平降低，大、中劑量組較之差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05);維酶素組LPO 水平與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。見表2。

表2 各組大鼠胃黏膜T-AOC 和LPO 水平的影響 ±s

表2 各組大鼠胃黏膜T-AOC 和LPO 水平的影響 ±s

注:與空白對照組對比，＊＊ P ＜0．01;與模型對照組對比，#P ＜0．05。

組 別 動物數(shù) 劑量/(g·kg －1) T-AOC/(U·mg prot －1) LPO/(nmol·mg prot －1)6．20 ±0．89 8．51 ±1．80模型對照組 9 — 4．85 ±0．82＊＊ 11．71 ±2．62＊＊益氣活血中藥大劑量 9 0．60 6．10 ±0．95# 9．32 ±2．02#益氣活血中藥中劑量 9 0．30 6．06 ±1．21# 9．08 ±2．03#益氣活血中藥小劑量 9 0．15 5．98 ±1．08 9．71 ±2．89維酶素組 9 0．25 5．75 ±0．92 9．33 ±2．56空白對照組 9 —#

3 討 論

慢性萎縮性胃炎屬中醫(yī)學(xué)“痞滿”“胃脘痛”范疇，主要病理機制為氣血兩虛、瘀血內(nèi)停的虛實夾雜之證，其中血瘀是CAG 的主要病理基礎(chǔ)。因本病病程遷延，反復(fù)難愈，病變由氣入血，由經(jīng)入絡(luò)，又易導(dǎo)致因虛致瘀的病理改變，此與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“胃黏膜血循環(huán)障礙”的認識相一致［5］。益氣活血法為臨床常用防治CAG 的治則治法之一。

有研究［6］表明:氧自由基與急慢性胃黏膜損傷、慢性萎縮性胃炎和胃癌的形成有密切關(guān)系。在正常生理條件下，機體內(nèi)存在著自由基的清除系統(tǒng)，其中T-AOC 是機體內(nèi)抗氧化力量的總體體現(xiàn)，是機體對抗氧自由基損傷的主要體系，是可以反映機體對外來刺激代償能力及抗氧化能力的良好指標(biāo)［7］。筆者在實驗中發(fā)現(xiàn):CAG 模型大鼠胃黏膜LPO 水平明顯升高，而T-AOC 水平明顯下降，尤其是局部胃黏膜自由基代謝異常時更明顯。此說明了自由基代謝異常在CAG 中起著重要作用。

NO 是一種神經(jīng)遞質(zhì)和信使分子，由NOS 催化底物左旋精氨酸產(chǎn)生。NOS 主要有兩種異構(gòu)體，即原生型(CNOS)和誘生型NOS(iNOS)。其中iNOS 幾乎分布于所有組織中，在受到內(nèi)毒素或各種細胞因子刺激后被激活，可生成大量NO。NO 的作用因劑量、作用時間的不同而有很大差異，如:早期、小劑量NO 可以抑制內(nèi)皮素產(chǎn)生，增加胃黏膜血流量，具有細胞保護作用。當(dāng)iNOS 被激活釋放大量NO 時，過量生成的NO 一方面將發(fā)揮其自由基(或繼發(fā)生成的高活性羥自由基)性質(zhì)的細胞毒作用，直接損害胃黏膜血管內(nèi)皮細胞，刺激NO 更多釋放，形成惡性循環(huán);另一方面失去對ET 的抑制，減少胃黏膜血流量，造成胃黏膜缺血－再灌流損傷。同時，NO 是抑制性非腎上腺非膽堿能神經(jīng)的轉(zhuǎn)遞和調(diào)節(jié)遞質(zhì)。NO 的釋放可以延長消化間期移動性復(fù)合運動波相時間，引起胃排空延長［8－9］，從而誘發(fā)胃動力障礙。益氣活血中藥治萎防變膠囊主要由人參、枳實、白術(shù)、半夏、白花蛇舌草、三七等藥味經(jīng)過提取、分離而組成，主治氣虛血瘀型慢性萎縮性胃炎?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明:人參［10］、枳實［11］、白術(shù)［12］、半夏［13］、白花蛇舌草［14］、三七［15］所含有效成分具有不同程度改善胃腸平滑肌運動、解痙鎮(zhèn)痛、抗自由基損傷、抑制血小板聚集、抑殺幽門螺桿菌，以及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抗腫瘤的作用。本研究結(jié)果顯示:益氣活血中藥治萎防變膠囊可通過提高胃黏膜組織抗氧化能力、減輕自由基膠聯(lián)損傷來發(fā)揮保護胃黏膜的作用。

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