高糖環境下脂聯素對人心肌細胞增殖的影響

張俊潔 李興

近年來，糖尿病心血管疾病已成為糖尿患者死亡主要原因之一，而未治療的糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy，DCM)能迅速發展為心功能衰竭，所以其發生及發展過程中心肌病變的研究漸為人們所重視。多項研究認為糖尿病患者高血糖通過蛋白激酶C機制，參與糖尿病并發癥的發生、發展。脂聯素(Adiponectin，ADPN)是近年研究的熱點，許多研究顯示脂聯素在心衰和心室重構過程中起到重要作用［1，2］，具有心臟保護功能。但國內外關于脂聯素對高糖環境中HCM增殖報道較少，本研究旨在探討高糖環境下脂聯素對HCM增殖的影響，以揭示脂聯素對高糖環境下人心肌細胞的可能保護作用，從而為預防、治療糖尿病心肌病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人心肌細胞購于北方偉業發展有限公司，DMEM培養基、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青)，D-2葡萄糖、MTT試劑盒(美國Sigma公司)，脂聯素Human gAcrp(Pep rotech)，Trizol試劑(上海生工生物工程技術服務有限公司)。

1.2 人心肌細胞的培養及分組 HCM培養于含10%胎牛血清、5.5 mmol/L D-葡萄糖、100U/ml鏈霉素的DMEM培養液，并置于含5%CO2的37°恒溫培養箱中孵育，每3～4天用0.25%胰酶消化傳代，待細胞生長成亞融合狀態時。取部分細胞以1×104/ml接種于96孔細胞培養板，待細胞貼壁后，改用無血清DMEM培養液使細胞同步化生長24 h后，棄上清液，將其分為正常對照組(5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液)、高糖組(30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液)、脂聯素組 (30.0 mmol/L+2.5 μg/mlADPN的DMEM培養液)，以備MTT用。剩余細胞換為無血清DMEM培養液使細胞同步化生長24 h后，將其分為正常對照組(5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液)、高糖組(30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液)、脂聯素組 (30.0 mmol/L+2.5 μg/mlADPN的DMEM培養液)。

1.3 MTT法測HCM增殖 每組設4個復孔，同時設調零孔，進行培養，為排除營養成分消耗對試驗結果產生誤差于48 h更換培養液一次。培養24、48、72 h后進行MTT檢測，每孔加入 5 mg/ml的 MTT20 μl，繼續孵育 4 h，吸取上清，每孔加入二甲基亞楓(DMSO)150 μl，振蕩 10 min，于酶標儀490nm處測吸光度(OD值)。

2 結果

在24 h高糖組與正常組比較人心肌細胞增殖有促進作用(P＜0.05)，而高糖組與脂聯素組比較沒有統計學差異(P＞0.05)。48、72 h高糖組與正常對照組比較細胞增殖受抑制(P＜0.05)。在加入脂聯素后48、72 h脂聯素組與高糖組比較細胞增殖增加，隨時間的延長細胞增殖增加明顯，有統計學差異(P＜0.01)。(見表1)

表1 脂聯素對高糖環境下HCM增殖的影響(OD值)(±s)(n=3)

表1 脂聯素對高糖環境下HCM增殖的影響(OD值)(±s)(n=3)

注:*P＜0.05;#P＜0.01

?

3 討論

糖尿病性心肌病是一種特異性的心肌病，是糖尿病的嚴重慢性并發癥之一，其典型病理改變為心肌細胞肥大，心肌間質增生及纖維化、心肌局灶性壞死、心肌血管壁增厚等。Braunwald等［3］認為糖尿病心肌病的可能原因包括膠原和終末糖基化產物修飾的細胞外基質蛋白積聚，導致心肌的順應性和舒張功能受損，心肌鈣調控異常，蛋白激酶-C(PKC)的激活，心臟自主神經功能紊亂，基因突變等。病程早期以心臟舒張功能異常為主，后期收縮功能也受損，出現心力衰竭的臨床表現。其中，心肌細胞功能受損是糖尿病心肌病發生、發展的關鍵。

本研究結果顯示，高糖環境下心肌細胞的增殖受到抑制，可能是由于高糖通過葡萄糖依賴性通路選擇性激活PKC，尤其是PKC-β1.從而引起細胞信號傳導異常而引起細胞凋亡和纖維化。Min等［4］通過對NF-кB途徑抑制檢測新生大白鼠心肌細胞中 PKC/NF-кB/TNF-а、c-fos表達，認為高血糖可以通過 PKC/NF-кB/TNF-а、c-fos信號轉導途徑引起心肌細胞肥大。高糖還可激活p38MAKP，直接底物磷酸化AP-1、c-myc、c-jun 等，調節基因表達［5］，促進心肌細胞肥大。

ADPN是近年發現的一種由白色脂肪組織分泌的蛋白產物，由位于3q27的apM1基因編碼，相對分子質量約3×104，具有244個氨基酸殘基。正常情況下，ADPN的血漿濃度為5～30ug/ml，約占總血漿蛋白量的0.01%。其是一種具有對糖尿病保護作用的蛋白質，多項研究證明其具有抗炎、抗纖維化、抗動脈粥樣硬化等多種作用。國外實驗研究，Yajing［6］等對雄性小鼠心肌細胞經脂聯素干預后也發現細胞死亡減少，起到對糖尿病心肌保護作用。對多種細胞研究顯示［7］:在活體內ADPN下調Bcl-2基因的表達，同時也可能抑制NF-Kb以及上調VEGF的轉錄因子的激活。但目前對糖尿病心肌病研究較少，尤其脂聯素對心肌細胞保護的機制尚不清楚，本實驗結果示加入脂聯素后阻斷了高糖對心肌細胞的損害，HCM增殖能力增加，并呈時間依賴性，提示脂聯素可能通過抗炎、抗纖維化作用直接或間接起到保護心肌細胞的作用，為臨床應用脂聯素治療糖尿病心肌病提供了理論依據。

［1］Fujioka D，Kawabata K，Saito Y，et al.Role of adiponectin receptors in endothelin-induced hypertrophy in cultured cardiomyocytes and their expression infracted heart.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290:H2409-H2416.

［2］Liao Y，Takashima S，Maeda N，et al.Exacerbation of heart failure in adiponectin-deficient mice due to impaired regulation of AMPK and glucose metabolism.Cardiovasc Res，2005，67:705-713.

［3］Braunwald.Heart disease:A Textbook of Cardiovascular Medicine.6thed，2001:2133-2150.

［4］Min W，Bin ZW，Quin ZB，et al.The signal transduction pathway of PKC/NF-kappaB/c-fos may be involved in the influence of high glucose on the cardiomyocytes of neonatal rats.Cardiovasc Diabetol，2009，11:8-8.

［5］Way KJ，Isshiki K，Suzuma K，et al.Expression of connective tissue growth factor is increased ininjured myocardium associated with protein kinase C beta2 activation and diabetes.Diabetes，2002，51(9):2709-2718.

［6］Min W，Bin ZW，Quin ZB，et al.The signal transduction pathway of PKC/NF-kappaB/c-fos may be involved in the influence of high glucose on the cardiomyocytes of neonatal rats.Cardiovasc Diabetol，2009，11:8-8.

［7］Yajing W，Erhe G，Ling T，et al.AMP-activated protein kinase deficiency enhances myocardial ischemia/reperfusion injury but has minimal effect on the antioxidant/antinitrative protection of adiponectin.Circulation，2009，119:835-844.