BHRF1基因與綠色熒光蛋白融合基因慢病毒載體的構建

張艷平 (常德職業技術學院醫學系，湖南 常德 415000)

BHRF1基因是凋亡抑制基因，其編碼的蛋白能通過多種途徑抑制細胞凋亡的發生，最終導致細胞癌變。BHRF1蛋白與鼻咽癌的發生發展有很大關系，這對鼻咽癌的診斷、治療和預后具有重要意義。基因載體的選擇與構建合適的載體系統是基因治療的關鍵之一〔1〕。慢病毒(LV)不僅具有可感染分裂細胞及非分裂細胞、轉移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發宿主免疫反應等優點，還進一步提高了基因表達的安全性〔2，3〕。本研究中構建BHRF1表達載體，以期在真核細胞中高效、穩定表達，從而為進一步從分子水平探討BHRF1分子機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒及細胞 大腸桿菌TOP10購于華美生物工程公司;LV包裝體系pWPXL Lentivector Packaging Kit(質粒pWPXL-IRES-GFP、包裝質粒HELPER和包膜質粒VSVG)購自美國System Biosciences公司;293T細胞購自中國科學院典藏細胞委員會細胞庫。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶EcoR I、Mlu I，T4連接酶及DNA聚合酶購于TaKaRa公司;Trizol total RNA試劑盒、PCR反應試劑盒、質粒小抽試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒等分別購于Axrgen公司和TOYOBO公司;Lipofectamine2000購于Invitrogen公司，DMEM培養基及小牛血清購于Hyclone公司;主要試劑為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 BHRF1基因的一對擴增引物如下：BHRF1-前向：5'-GGAATTCTTACATGGCGCTAACCTCCATC-3'，BHRF1-反向：5'-CGGGATCCTGCTGTCAACTCCAACACAGGATGCAAAC C-3'。上游引物均從5'開始，添加了EcoR I酶切位點(GAATTC)，下游引物均從 5'開始，添加了 BarnH I酶切位點(GGATCC)。引物由北京鼎國公司合成。

1.2.2 BHRF1基因RT-PCR擴增 將收集保存于液氮中的鼻咽癌組織標本取出后迅速放入干冰中，在樣品冰凍的狀態下，切取、稱量1 mg，添加1 ml 4℃預冷的Trizol，在冰上進行組織研磨，參照Trizol total RNA試劑盒說明書，采用一步法提取鼻咽癌組織中的總RNA后再逆轉錄為cDNA。以BHRF1基因cDNA為模板，進行PCR擴增。擴增體系：10×緩沖液 5 μl，MgSO4(50 mmol/L)2 μl，Template(plasmid DNA)1 μl，Taq HiFi(5 U/μl，Invitrogen)0.2 μl，上、下游引物(10 μmol/L)1 μl、dNTP(10 mmol/L)1 μl，加 ddH2O 至 50 μl。PCR 循環反應條件：94℃預變性 3 min;94℃ 30 s，56℃ 1 min，68℃ 1 min 10 s，共35個循環;最后72℃延伸10 min。反應結束后，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行鑒定。

1.2.3 BHRF1基因的LV表達載體的構建 回收純化PCR產物，用限制性內切酶EcoR I、Mlu I分別雙酶切PCR產物與LV表達載體，T4 DNA連接酶將回收純化的PCR產物連接于線性化的LV表達載體中。連接體系為：10×T4連接酶緩沖液1 μl，T4 連接酶 1 μl，目的片段 2 μl，pWPXL-IRES-GFP 病毒 1 μl，補ddH20至10 μl，16℃連接過夜。將5 μl連接產物轉化至TOP10感受態細胞，37℃ 250/min振蕩培養45 min。收集菌液，取200 μl涂布于LB平皿中，37℃倒置培養過夜。挑取單個菌落，限制性內切酶對重組質粒進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。陽性克隆送上海生工技術有限公司測序。

1.2.4 LV顆粒的制備 培養293T細胞，并于感染前1 d接種到直徑10 cm的培養皿，采用磷酸鈣沉淀法將LV載體三質粒細胞包裝系統(表達質粒pWPXL-hBHRF1-IRES-GFP、包裝質粒HELPER和包膜質粒VSVG)共轉染293T細胞。轉染后24 h，用含1%小牛血清白蛋白(FBS)的DMEM換液轉染48 h后，收集病毒上清，4℃下50 000 r/min離心2.5 h沉淀病毒顆粒，棄上清，1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸病毒，10 μl/EP管進行分裝，－70℃保存。

1.2.5 LV滴度的測定 293T細胞用含有10%FBS的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中常規培養。轉染前1 d以2×105/孔接種入6孔板中，孵箱中培養至細胞50%融合。棄去細胞培養液，按階梯稀釋法將LV液稀釋10－1～10－5共5個濃度(終體積1 ml)，分別加至6孔板中。病毒滴度測定：72 h后熒光顯微鏡下計數綠色熒光蛋白(GFP)陽性細胞數以計算病毒滴度(病毒滴度=GFP陽性細胞率×細胞總數/LV液體積×LV液稀釋倍數)(TU/ml)。取各組平均值計算滴度。

2 結果

2.1 BHRF1 cDNA的鑒定結果 以BHRF1 cDNA為模板進行PCR擴增，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定PCR產物：電泳圖中可見PCR擴增的780 bp大小的目的片段，初步判定PCR擴增出BHRF1全編碼序列。DNA測序結果顯示目的基因擴增正確，無堿基突變及缺失。見圖1。

圖1 RT-PCR結果

圖2 重組慢病毒鑒定結果

2.2 重組LV表達載體pWPXL-hBHRF1-IRES-GFP的構建及鑒定 重組質粒轉化TOP10感受態細胞，挑取單個菌落進行菌落PCR，限制性內切酶Mul I及EcoR I對PCR產物進行雙酶切鑒定結果：可見780 bp大小的目的條帶和LV表達載體載體pWPXL-IRES-GFP片段，說明Atoh1已經重組于pWPXL-IRESGFP vertor內，再次測序結果表明目的基因插入方向和序列完全正確，證明重組LV表達載體構建成功。見圖2。

2.3 LV載體系統的鑒定 取病毒上清感染293T細胞24 h后，熒光顯微鏡下可觀察到大量GFP表達，熒光蛋白表達效率達90%，確定病毒滴度為1.0×108ifμ/ml。提示重組LV在體外培養條件下能使真核細胞顯著表達外源基因。見圖3。

圖3 慢病毒上清感染293T細胞后24 h熒光檢測(×100)

3 討論

BHRF1基因所編碼的BHRF1蛋白分子A鏈 (類型為多肽)，長度為173，BHR F1蛋白分子 B鏈片段長度從1～160。Bcl-2基因屬于細胞凋亡因子，也是細胞存活促進因子，屬膜整合蛋白，分子量為26 kD，定位于線粒體、內質網和連續的核周膜。BHRF1基因所編碼的BHRF1蛋白與Bcl-2基因所編碼的Bcl-2蛋白有很高的同源性，其功能也有很高的相似性〔4〕。有研究顯示bcl-2基因與鼻咽癌尤其是晚期癌細胞轉化密切相關，同時還提示bcl-2基因表達有促進淋巴結轉移的作用〔5〕。然而BHRF1基因是否參與了鼻咽鱗癌細胞凋亡調節，需要進一步研究證實。

基因載體的選擇與構建合適的載體系統是基因治療的關鍵之一。目前在以基因治療為目的的載體系統中，病毒載體顯得格外令人關注〔6〕。本課題所選用的LV不僅具有可感染分裂細胞及非分裂細胞、目的基因表達時間長、轉移基因片段容量較大、不易誘發宿主免疫反應等優點，還進一步提高了基因表達的安全性〔7〕。不僅克服了以往逆轉錄病毒表達沉默的缺陷，而且轉基因的效率遠遠高于傳統的顯微注射法，是轉基因研究領域的突破性進展。

為了更進一步探索BHRF1基因對在鼻咽癌的作用機制及生物活性，本實驗正確擴增出BHRF1基因全長編碼序列，并成功構建帶有熒光標記的LV表達載體。包裝后的LV轉染293T細胞，顯微熒光靜下觀察到熒光蛋白表達，轉染效率達90%，表明所構建LV顆粒可高效轉染真核細胞，這為進一步研究BHRF1基因的相關功能提供了適合的穩定轉染載體。

1 趙世巧，馮文莉.基因治療的病毒載體研究進展〔J〕.國外醫學·臨床生物化學與檢驗學分冊，2005;26(10)：709-11.

2 Gilad AA，Winnard PT Jr，van Zijl PC，et al.Developing MR reporter genes：promises and pitfalls〔J〕.NMR Biomed，2007;20(3)：275-90.

3 Mandel RJ，Burger C，Snyder RO.Viral vectors for in vivo gene transfer in Parkinaon's disease：properties and clinical grade production〔J〕.Exp Neurol，2008;209(1)：58-71.

4 歐陽為明，張繼帥，金伯泉.PCDM8-GFP報告載體的構建及鑒定〔J〕.第四軍醫大學學報，2003;24(2)：131-2.

5 Pang J，Cheng M，Haire SE，et al.Efficiency of lentiviral transduction during development in normal and rd mice〔J〕.Mol Vis，2006;12：756-67.

6 Sinn PL，Sauter SL，McCray PB Jr.Gene therapy progress and prospects：development of improved lentiviral and relroviral vectors-design biosafety and production〔J〕.Gene Ther，2005;12(14)：1089-98.

7 Kim BH，Han YS，Choe BK，et al.The escape of temperature-sensitive T antigen immortalized rat hepatocytes from conditional immortalization〔J〕.Cell Transplant，2005;14(7);507-17.