糖尿病加劇小鼠腦缺血后腦內自噬活性的增高

張 婷 王紅梅 李 強 孫曉江 (上海交通大學附屬第六人民醫院神經內科，上海 200233)

自噬是細胞對于環境變化的有效反應，維持細胞代謝的轉換及動態平衡，對新陳代謝起著舉足輕重的作用，可以作為一種防御機制清除胞質內受損的細胞器、代謝產物及病原體，進行亞細胞水平上的重構，保護受損的細胞。然而，自噬過度激活可以誘導細胞程序性死亡，稱為Ⅱ型程序性細胞凋亡，從而引起一系列的疾病〔1，2〕。一些觀點認為在缺血早期，腦內自噬途徑過度激活是有害的〔3〕，但有的觀點認為這是機體的潛在保護機制〔4〕。本文采用實驗性動物模型，觀察DM小鼠短暫性腦缺血引起的腦內自噬活性的改變。

1 對象與方法

1.1 實驗動物 選擇C57BL/6小鼠及沙士鼠。

1.2 方法

1.2.1 實驗性DM小鼠模型 在實驗開始時，實驗動物隨機分為四組：假手術(Sham)組、腦缺血(VO)組，DM-假手術(DMSham)組和 DM-腦缺血(DM-VO)組。參照 Zhang等方法〔5〕，以腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導DM模型動物;同齡正常對照小鼠腹腔注射空白對照溶液(檸檬酸緩沖液，pH4.2)。STZ注射4 w后，小鼠尾端采血，Roch血糖儀及試紙檢測血糖，以空腹血糖＞8.0 mmol/L作為DM誘導成功的判斷標準。選擇符合條件的DM小鼠進行后續試驗。

1.2.2 短暫性腦缺血模型的制作 C57BL/6小鼠及沙土鼠缺乏后交通動脈及完整的基底動脈環，兩側大腦供血相對獨立，通過閉塞一側或雙側頸動脈即可復制效果明顯的同側或雙側腦缺血模型〔6〕，所以雙側頸總動脈夾閉(CCAO)術被廣泛用于中風病理機制研究。術前2 h禁食，自由飲水。以10%水合氯醛麻醉成功后，仰臥固定于手術臺上，頸部皮膚剪毛備皮，碘酒酒精消毒，以無菌器械沿頸部正中切開皮膚及皮下組織，暴露頸部肌肉后，在一側頸前肌肉和側方肌肉間隙鈍性分離該側頸總動脈，并避免損傷伴隨頸總動脈行走的迷走神經，以同樣方法分離對側頸總動脈，以2個小號外科血管夾分別夾畢雙側頸總動脈。雙側頸總動脈同時夾畢30 min后，松開血管夾，使血流再通，傷口內撒入少許青霉素，間斷縫合皮膚，縫合完畢后酒精消毒傷口。術后送回籠中飼養。

1.2.3 透射電鏡 取分離腦組織用震動切片機切成超薄切片(100 nm)，參照文獻〔7〕進行后續處理。采用JEOL JEM-1230透射電鏡(JEOL，Japan)進行觀察。

1.3 統計學方法 應用SPSS11.5統計軟件進行分析，所有數據均采用s表示，多組間比較采用單因素方差分析，用LSD法進行兩兩比較。

2 結果

2.1 各組小鼠血糖水平比較 STZ處理后4 w，與非DM小鼠〔Sham 組(6.4±0.3)mmol/L〕，VO組(5.6±0.5)mmol/L，n=8)〕比較，DM小鼠血糖水平顯著升高〔(DM-Sham組(17±1.4)mmol/L，DM-VO 組(14.2 ± 1.2)mmol/L，n=8，P＜0.05〕。更重要的是，STZ治療4 w后，與非DM小鼠對比，DM小鼠表現出多飲、多尿、多食和體重下降。

2.2 電鏡檢查自噬體形態 Sham組內質網、線粒體和突觸等細胞器形態正常，細胞質內囊泡樣小體(V)、自噬溶酶體(al)、環形多層膜結構(avm)以及自噬囊泡樣電子致密物(avd)表達很少。而DM-VO組細胞質內V、al、avm以及avd表達顯著增高。見圖1。

圖1 DM腦缺血實驗小鼠腦內自噬體的表達

2.3 各組自噬活性標記物LC3-Ⅱ表達水平 通過免疫印跡方法檢測CCAO后實驗動物在1 d、2 d、3 d及1 w時腦內LC3-Ⅱ的表達水平，與Sham組相比，缺血后LC3-Ⅱ表達增高，持續至少3 d。與Sham組比較，VO組在1 d(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比率：皮層9.5±1.0，海馬11.1±1.6，n=4)表達接近高峰，DM-Sham組(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值：皮層1.4 ±0.1，海馬3.8 ±1.0，n=5)LC3-Ⅱ表達增高，DM-VO組(術后1 d時LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值：皮層3.1±0.5，海馬1.3±0.1，n=4)較VO組LC3-Ⅱ表達顯著增高(P＜0.05)。

3 討論

近年來自噬受到科學界的重視，2004年《科學》雜志曾對2005年科技領域將要發生的六件大事進行了預測，自噬作用研究位列第一。隨著近年來對自噬機制的深入研究，已經驗證了《科學》雜志當年的預測，發現其與很多疾病有密切的聯系，諸如神經退行性病變、腫瘤、心肌病、病原微生物侵入感染以及老化等。自噬-溶酶體途徑是真核細胞對于外界環境營養物質變化的一種適應性機制。細胞在營養物質貧乏的情況下，自噬途徑被激活，從而代謝出一些基本的營養物質。在細胞老化過程中，不斷產生有錯誤折疊的蛋白質、有害的代謝產物或是老化的細胞器如線粒體等。在病理生理情況下，自噬溶酶體途徑調控短壽命和長壽命蛋白、細胞器降解，從而保證蛋白質正常工作，維持細胞的正常功能和生存，改善實驗動物的行為學表現〔8〕。而電鏡檢查自噬體形態是檢驗自噬活性的金標準。本研究中，通過電鏡和免疫印跡方法發現，DM-VO組細胞質內V、al、avm以及avd表達增高最為顯著。自噬活性與應激相關，提示腦缺血(尤其是DM腦缺血)后腦內應激水平增高。

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2 Klionsky DJ，Emr SD.Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation〔J〕.Science，2000;290(5497)：1717-21.

3 Puyal J，Vaslin A，Mottier V，et al.Postischemic treatment of neonatal cerebral ischemia should target autophagy〔J〕.Ann Neurol，2009;66(3)：378-89.

4 Carloni S，Buonocore G，Balduini W.Protective role of autophagy in neonatal hypoxia-ischemia induced brain injury〔J〕.Neurobiol Dis，2008;32(3)：329-39.

5 Zhang T，Liu X，Li Q，et al.Exacerbation of ischemia-induced amyloidbeta generation by diabetes is associated with autophagy activation in mice brain〔J〕.Neurosci Lett，2010;479(3)：215-20.

6 Fujii M，Hara H，Meng W，et al.Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice〔J〕.Stroke，1997;28(9)：1805-10.

7 Martone ME，Jones YZ，Young SJ，et al.Modification of postsynaptic densities after transient cerebral ischemia：a quantitative and three-dimensional ultrastructural study〔J〕.J Neurosci，1999;19(6)：1988-97.

8 Ravikumar B，Vacher C，Berger Z，et al.Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease〔J〕.Nat Genet，2004;36(6)：585-95.