SEA誘導人膀胱癌T24細胞周期進程及凋亡

孟勇男 孫立群 (白山市中心醫院泌尿外科，吉林 白山 34300)

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一〔1〕。由于膀胱癌具有異質性，其生物學行為復雜多變，因而影響膀胱癌的治療和預后。本研究應用葡萄球菌腸毒素A(SEA)誘導人膀胱癌T24細胞，觀察其生物學行為變化，旨在為人膀胱癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌T24細胞株，吉林省腫瘤研究所惠贈。SEA由軍事醫學科學院微生物流行病學研究所提供;噻唑藍(MTT)試劑、RPMI 1640培養基購于美國Sigma公司，胎牛血清購于長春生物制品研究所。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 取指數生長期的人膀胱癌T24細胞，調細胞數為2×105/ml;接種于96孔塑料培養板內100 μl/孔，當細胞生長達到80%匯合時，每孔內分別加入不同濃度的SEA溶液0、20、40、80 ng/ml，每個濃度10 復孔，靜止培養24 h，于結束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L，繼續培養6 h后加入二甲基亞砜溶液150 μl/孔，振蕩5 min，使MTT還原產物完全溶解，于酶標儀570 nm處測量各孔吸光度A值，按下列公式計算T24細胞的增殖抑制率。T24細胞抑制率=(1－加藥孔細胞A值÷對照孔細胞值)×100%。

1.2.2 流式細胞術 細胞培養及分組同1.2.1，不同之處是將96孔培養板改為25 ml培養瓶，培養結束后用0.25%胰蛋白酶消化。收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定，上機前過40目網，調細胞數為1×106/ml，碘化丙啶(PI)染色，流式細胞儀檢測，細胞周期結果以Modiffi 2.0軟件分析。

1.2.3 透射電鏡觀察 細胞培養及分組同1.2.2，收集不同濃度的SEA作用的T24細胞，移入錐形離心管內，離心棄上清，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛-鈾雙重染色，透射電鏡觀察并拍照。

1.3 統計學方法 應用SPSS11.0統計軟件進行分析，數據資料以s表示，組間比較采用t檢驗，F檢驗。

2 結果

2.1 MTT結果 不同濃度的SEA對T24細胞的增殖均有抑制作用，且呈劑量依賴性，與對照組相比差異顯著(P＜0.01)。見表1。

2.2 流式細胞術結果 不同濃度的SEA對T24細胞增殖均有影響，G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期細胞相對增多，組間比較差異顯著。見表2。

2.3 透射電鏡結果 見圖1。20 ng/ml SEA組，T24細胞膜破裂，線粒體腫脹，有空泡形成;40 ng/ml SEA組，細胞核染色質趨邊凝集，大量空泡形成;80 ng/ml SEA組，細胞核破裂，可見凋亡小體改變。

表1 不同濃度的SEA對T24細胞的增殖抑制率(s)

表1 不同濃度的SEA對T24細胞的增殖抑制率(s)

組別 A值 抑制率 P值

表2 不同濃度的SEA對T24細胞周期進程的影響( s ，%)

表2 不同濃度的SEA對T24細胞周期進程的影響( s ，%)

與0 mg/ml組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

29.6±2.1 63.2±3.4 7.1±1.9 20 ng/ml組 42.6±3.81) 41.4±392) 15.9±2.62)40 ng/ml組 51.3±1.61) 29.6±3.32) 19.1±2.72)80 ng/ml組 59.3±0.212) 19.9±2.42) 21.2±3.12)/M 0 ng/ml組組 別 G0/G1 S G2

圖1 各組細胞透射電鏡下改變

3 討論

SEA是一組對熱穩定的可溶性蛋白質，能抵抗胃腸液中蛋白水解酶的水解作用，是食物中毒和毒素性休克的常見病因〔2〕。SEA殺傷腫瘤細胞有兩種途徑：(1)直接的細胞毒效應，(2)間接殺傷腫瘤細胞，不需加工直接與自身組織相容性復合體(MHC)Ⅰ類分子結合形成配體，通過該配體抑制細胞增殖。王琳〔3，4〕等分別應用抗體耦聯SEA和直接應用SEA對荷瘤小鼠的治療獲得較為滿意的結果。

本研究MTT結果顯示不同濃度的SEA對T24細胞增殖抑制率具有明顯的劑量依賴性。流式細胞儀結果顯示，不同濃度的SEA對T24細胞周期進程均有影響。G2/M期細胞增多是細胞損傷的普遍反映〔5〕。G1期細胞又稱細胞復制前期，G1期是制造和產生rRNA、mRNA和tRNA及核蛋白體的時期，也是多種化學藥物作用的敏感點〔6〕。因此，抑制G1期細胞進程，從而使細胞增殖變緩，可達到抑制腫瘤增殖的目的〔7〕。

本研究證明SEA具有直接的細胞毒作用，可用于腫瘤的治療。尤其是膀胱癌屬于腔內淺表腫瘤，直接膀胱灌注即能殺傷腫瘤細胞，又便于直接排出體外，避免毒副作用的產生，因此，SEA用于膀胱癌的治療有廣闊的應用前景。

1 張 宇，倪澤稱，胡嵐亭，等.雙色熒光原位雜交技術在膀胱尿路上皮腫瘤診斷中的應用價值〔J〕.國外醫學腫瘤雜志，2012;39(3)：237-40.

2 Thomas D，Chou S，Dauwalder O，et al.Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins〔J〕.Chem Immunol Allergy，2007;93：24-41.

3 王 琳，舒曉鋼.SEA-FAb'偶聯蛋白對胃癌的抑制作用及其機制〔J〕.中華實驗外科雜志，2003;20(5)：425-6.

4 張 云，孫嘉琳，王 雪，等.SEA體內殺傷S180肉瘤效果及其細胞因子測定〔J〕天津醫藥，2010;38(4)：313-5.

5 Eillnger-Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Celss，2000;5(6)：491-8.

6 Martin LG，Demers GW，Galloway DW.Disruption of the G1/S transition in human Papiloma Viras type/6 E7 expressing human cells in associated regulation of cyclin E〔J〕.J Virol，1998;72(2)：975-85.

7 Jie KG，Jiang H，Sun L，et al.The pilot study of anti-tumor effects versus immunosuppression of Staphylococcal Enterotoxin C〔J〕.Cancer Biol T-her，2007;6(10)：1584-91.