龍眼參黃酮對大鼠局灶性腦缺血損傷及抗氧化酶活性的影響

金 輝 楊 煜 呂若谷 謝 宇 呂文偉 (吉林省人口生命科學(xué)技術(shù)研究院，吉林 長春 006)

龍眼參Longyanshen，LYS原植物為蝶形花科植物蔬葉崖豆Millettia pulchra Kura Var.laxior(Dunn)Z.Wei的塊跟〔1〕，是廣西民間廣泛應(yīng)用的壯藥。前期實(shí)驗(yàn)證明，龍眼參黃酮對犬急性心肌缺血時心外膜電圖及心肌酶具有一定的影響〔2〕，能夠改善急性心肌缺血所致的心肌光鏡及電鏡下細(xì)胞的損失程度〔3〕;同時，龍眼參黃酮具有減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用〔4〕，清除機(jī)體氧自由基〔5〕。本實(shí)驗(yàn)研究龍眼參黃酮對局灶性腦缺血大鼠的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 步長腦心通膠囊由陜西咸陽步長制藥有限公司提供，批號：060823。氯化三苯基四氮唑(TTC)由上海化學(xué)試劑公司提供，批號：20091009。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.2 動物 健康雄性Wistar大鼠，體重250～350 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)研究中心提供，動物合格證號：SCXK-(吉)2003-0001。

1.1.3 儀器 722型分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);CS501恒溫浴槽，南通科學(xué)儀器廠生產(chǎn);LDZ5-2型離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn);DT-500型電子天平，常熟雙杰測試儀器廠生產(chǎn);LEICA QWIN圖像分析儀。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局灶性腦缺血模型(MCAO)制備 取48只雄性大鼠，隨即分為假手術(shù)組、模型組、陽性藥組(步長腦心通2.0 g/kg)及龍眼參黃酮高、中、低劑量組(2.0、4.0和8.0 g/kg)。每天灌胃給藥一次(假手術(shù)組和模型組給予等容積生理鹽水)，連續(xù)給藥7 d。末次給藥1 h后，模型組、陽性藥組及龍眼參黃酮各劑量組大鼠稱重后腹腔注射水合氯醛(0.3 g/kg)麻醉，仰臥位固定于鼠板上。剪開頸部正中皮膚，鈍性分離并暴露左側(cè)頸總及頸內(nèi)、外動脈，并在頸內(nèi)外動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈，左側(cè)頸總動脈分叉處剪口，插入頭端燒成圓鈍形直徑為0.25 mm的尼龍線，進(jìn)線長度約18～20 mm，在大腦中動脈起始端堵塞大腦中動脈，然后將頸總動脈連同尼龍線一起結(jié)扎，逐層縫合后放回籠內(nèi)。術(shù)后37℃保溫，待動物清醒后通過Zea Longa神經(jīng)功能學(xué)評分判定是否造模成功。假手術(shù)組只分離、暴露血管，不結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈，不插入尼龍線。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分的測定 按文獻(xiàn)〔6〕所述，待大鼠清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分：0分，無神經(jīng)功能缺失癥狀;1分，梗死對側(cè)前爪內(nèi)收、不能伸直;2分，前肢屈曲，對側(cè)抵抗推力下降，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分，行走時身體向偏癱側(cè)傾倒;4分，意識喪失，完全不能行走。

1.2.3 腦組織含水量測定 取48只雄性大鼠，分組、給藥及造模同前。大鼠麻醉后斷頭取腦，去除小腦、腦干及嗅球，電子分析天平稱取腦濕重，置于110℃烤箱中烘烤至恒重時稱取腦干重，按公式：腦組織含水量=(濕重－干重)/濕重，計(jì)算出腦組織的含水量。

1.2.4 腦梗死面積的測定 如前所述，大鼠麻醉后斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，從額板開始間隔2 mm冠狀切片，將切片置于1%TTC溶液中(37℃)避光孵育30 min，然后置于10%甲醛中固定，正常組織染成紅色，梗死區(qū)呈現(xiàn)白色。數(shù)碼相機(jī)攝像，利用LEICA QWIN圖像分析儀測定腦梗死面積，計(jì)算腦梗死面積占全腦面積的百分比。

1.2.5 大鼠血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的測定各組大鼠腹主動脈取血，3 000 r/min，離心10 min，吸取血清。按試劑盒說明測定血清GSH-Px、CAT、SOD和MDA的含量。

1.2.6 大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察 腦組織經(jīng)10%甲醛固定48 h后，脫水、固定、石蠟包埋、常規(guī)切片、HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，劑量資料以s表示。

2 結(jié)果

2.1 龍眼參黃酮對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦組織含水量、腦梗死面積以及血清中SOD、CAT、GSH-Px及MDA含量的影響 預(yù)防性給予龍眼參黃酮4.0和8.0 g/kg組在術(shù)后能減少局灶性腦缺血所致的大鼠神經(jīng)功能學(xué)變化(P＜0.05)。陽性藥組、龍眼參黃酮中劑量組大鼠腦組織的含水量明顯低于模型組(P＜0.05)，龍眼參黃酮大劑量組的作用更加明顯(P＜0.01)。龍眼參黃酮中、高劑量組大鼠的腦梗死面積明顯低于模型組(P＜0.05，P＜0.01)。龍眼參黃酮中、高劑量組大鼠血清SOD、CAT、GSH-PX含量高于模型組(P＜0.01，P＜0.001)，而血清MDA水平低于模型組。見表1。

表2 龍眼參黃酮對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能學(xué)、腦含水量評分以及血清SOD、CAT、GSH-Px及MDA含量的影響( s ，n=8)

表2 龍眼參黃酮對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能學(xué)、腦含水量評分以及血清SOD、CAT、GSH-Px及MDA含量的影響( s ，n=8)

與腦缺血模型組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01，3)P ＜0.001

組別 劑量(mg/kg)評分 腦含水量(%)腦梗死面積(%)SOD(U/ml)CAT(ml/L)GSH-Px(ml/L)MDA(nmol/ml)88±90.16 4.66±1.94模型組 － 3.25±0.71 78.88±7.61 28.38±4.57 151.38±10.77 9.06±2.23 266.13±48.54 6.63±1.73陽性藥組 2.0 2.38±0.531) 70.00±4.841) 23.25±3.011) 162.13±13.641) 11.14±2.071) 344.50±70.081) 5.43±1.261)龍眼參黃酮組 2.0 2.75±0.71 72.13±8.37 26.38±3.46 160.25±13.10 10.64±2.37 308.63±54.35 5.85±1.18 4.0 2.25±0.462) 69.50±6.281) 22.75±2.821) 166.25±8.502) 12.51±2.732) 349.23±54.391) 4.99±1.381)8.0 1.75±0.712) 67.50±6.952) 21.88±1.822) 168.75±6.922) 13.20±1.362) 398.25±46.313) 4.81±0.941)假手術(shù)組 － 0 66.88±7.22 0 175.25±24.50 14.67±1.94 414.

2.2 龍眼參黃酮對局灶性腦缺血大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響 假手術(shù)組：鏡下神經(jīng)元細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分布正常，神經(jīng)元胞體橢圓，有小突起，胞核呈圓形，核仁清晰，稍見極輕微腦水腫。模型組：鏡下腦組織嚴(yán)重水腫，部分神經(jīng)元變性壞死，表現(xiàn)為細(xì)胞胞體固縮，胞核固縮甚至消失，胞質(zhì)濃染著色較深，神經(jīng)元呈嗜伊紅深染的多角形或小圓形，可見嗜神經(jīng)現(xiàn)象;缺血區(qū)的腦組織結(jié)構(gòu)變得疏松，有篩狀軟化灶形成。陽性藥組：鏡下依然可見腦組織水腫，部分神經(jīng)元呈變性壞死，表現(xiàn)為胞質(zhì)呈嗜伊紅，胞體為三角形，膠質(zhì)細(xì)胞增生，可見嗜神經(jīng)現(xiàn)象;依然可見腦組織結(jié)構(gòu)疏松，篩狀軟化灶形成。龍眼參黃酮低劑量組：鏡下可見腦組織水腫，神經(jīng)元變性壞死壞死區(qū)內(nèi)組織結(jié)構(gòu)疏松，可見嗜神經(jīng)現(xiàn)象;腦組織結(jié)構(gòu)疏松，可見篩狀軟化灶。龍眼參黃酮中劑量組：鏡下可見腦組織水腫，大部分神經(jīng)元正常，表現(xiàn)為胞體有突起，胞核圓形，核仁清晰;但依然可見灶狀神經(jīng)元變性壞死改變，胞質(zhì)呈嗜伊紅改變，胞體為三角形;腦組織結(jié)構(gòu)疏松淡染。龍眼參黃酮高劑量組：鏡下可見腦組織水腫，大多數(shù)神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞分布結(jié)構(gòu)均無明顯異常。但依然可見少數(shù)神經(jīng)元呈變性壞死改變，其胞體為三角形，胞質(zhì)呈嗜伊紅增強(qiáng)，這些神經(jīng)元散在分布，無腦組織結(jié)構(gòu)疏松及篩狀軟化灶形成。見圖1。

圖1 龍眼參黃酮對局灶性腦缺血大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響(HE，×100)

3 討論

腦缺血損傷主要指由于腦動脈管腔狹窄或堵塞，局部腦血流量減少或突然中斷，造成腦動脈供應(yīng)區(qū)的腦組織供血、供氧、供能減少，出現(xiàn)去極化和炎癥反應(yīng);由于腦水腫和腦細(xì)胞壞死，繼而引起繼發(fā)性的血管內(nèi)皮損傷和自主神經(jīng)功能障礙的一種病理狀態(tài)〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明龍眼參黃酮可減輕缺血所造成的腦組織損傷和腦組織水腫，改善腦功能，對腦組織起保護(hù)作用。

自由基攻擊生物膜磷脂分子中不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，再經(jīng)過過氧化物酶分解生成MDA，最終使磷脂結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，生物膜受到嚴(yán)重的損害。MDA作為自由基引發(fā)的腦脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量多少直接反映自由基損傷程度。在腦內(nèi)清除自由基的系統(tǒng)中，SOD發(fā)揮著重要的作用。CAT、GSH-Px在細(xì)胞代謝過程中可還原或清除H2O2。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，龍眼參黃酮可增強(qiáng)機(jī)體對自由基的清除能力，減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，從而發(fā)揮對細(xì)胞膜的保護(hù)作用。

缺血性腦血管病多為腦血管痙攣或栓塞引起腦組織缺血缺氧而致能量耗竭、興奮性氨基酸釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基的產(chǎn)生等，導(dǎo)致腦組織水腫、神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，腦細(xì)胞的各種生物酶活性喪失或轉(zhuǎn)化為對腦細(xì)胞有損害的酶，線粒體破壞，功能喪失，溶酶體膜裂解，大量溶媒溢入細(xì)胞質(zhì)，促使腦細(xì)胞發(fā)生自溶。由此可見，自由基介導(dǎo)的自由基連鎖反應(yīng)是腦缺血后繼發(fā)性損傷的重要環(huán)節(jié)之一〔7〕。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M鏡下可見缺血區(qū)腦組織神經(jīng)元呈變性壞死缺血性改變，表明腦缺血模型是成功的。陽性藥組和龍眼參黃酮低、中劑量組的神經(jīng)元變性壞死改變略有減輕，高劑量組神經(jīng)元變性壞死輕微，未見篩狀軟化灶，治療效果明顯。

綜上所述，龍眼參黃酮對腦缺血具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抗氧化損傷實(shí)現(xiàn)的。

1 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)〔S〕.南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1990.

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