殼六糖治療翼狀胬肉的實驗研究

許 可 陳軍全 (廈門大學生命科學學院，福建 廈門 36005)

翼狀胬肉(Pterygium)是一種常見的眼表疾病，發病后可向中央角膜區移行，最終導致失明。與靜止型的翼狀胬肉相比，進展型的翼狀胬肉表現出很強的向角膜中央區遷移的特點。基質金屬蛋白酶(MMPs)可以降解細胞外基質(Eam)從而促進腫瘤細胞的遷移;在翼狀胬肉中已發現MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-8、MMP-9 的表達上調〔1〕。在一些病理過程中，細胞分泌MMPs的同時也分泌MMPs特異性抑制因子(TIMPs)。殼寡糖是殼聚糖部分降解的產物，已有研究發現殼六糖可以產生明顯的腫瘤抑制作用，當濃度為10 mg/kg時作用最強〔2〕。不僅如此，殼六糖對抑制腫瘤轉移也表現出良好效果〔3〕。

1 材料與方法

1.1 材料 殼六糖購自大連中科格萊克生物技術有限公司，MMP-9和TIMP-1單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。翼狀胬肉由昆明第一醫院提供。根據翼狀胬肉的組織形態學特性，將其分為靜止型(n=29)和進展型(n=20)。同時統計每個翼狀胬肉組織對應患者的年齡、性別等信息。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 將新鮮的翼狀胬肉組織切成均勻的兩部分，一份用4%多聚甲醛固定后櫻花冷凍包埋劑(OCT)包埋切片。切片厚度為6 μm。冰凍切片用4%多聚甲醛處理10 min，0.3%H2O2處理10 min消除內源性過氧化物酶活性。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，用0.2%Triton X-100孵育15 min。PBS洗3次后，用2%牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min。加一抗MMP-9(1∶50)4℃過夜孵育，加入二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒中對應的二抗，最后DAB顯色。光鏡下觀察后，用清水沖洗，蘇木素復染，中性樹膠封片。

1.2.2 翼狀胬肉原代細胞培養 取翼狀胬肉組織塊，利用添加雙抗的PBS液浸泡15 min，PBS清洗2遍(每遍浸泡5 min)備用。用解剖剪將其剪成1～2 mm左右的小塊。這些小組織塊用SHEM培養基培養于37℃、5%(V/V)CO2的細胞培養箱中。2 d更換一次培養液。細胞貼壁生長近80%后，棄培養液，用PBS清洗后加入適量的胰酶消化。待貼壁細胞變圓后，加培養液終止，并離心收集細胞用于后續實驗。〔后續研究均在MMP-9陽性表達的進展型翼狀胬肉組織培養的血管周上皮樣細胞(PECs)中進行〕。

1.2.3 細胞遷移實驗 消化PECs細胞后，用PBS清洗離心，細胞懸浮于無血清的SHEM培養液中。5×104個細胞接種于Transwell小室，每孔100 μl。設空白對照組(PBS)和不同濃度的殼六糖樣品組，下室加入體積分數為10% 新生牛血清的SHEM培養液。置37℃、5%(V/V)CO2的培養箱中，培養24 h后，棄去培養液，4%多聚甲醛4℃固定30 min，無菌水輕柔洗2次。用姬姆薩染料染色30 min后，用棉棒將膜上的細胞擦去，輕柔水洗，在顯微鏡下觀察并統計。

1.2.4 RNA提取和cDNA合成 接種2.5×105個/ml的PECs細胞于6孔板中，每孔2 ml，分別以終濃度100 μg/ml殼六糖和PBS處理48 h后收集細胞，用TRIzol試劑提取細胞總RNA。獲得的總RNA，以20 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。紫外吸收法測定總RNA在吸光度260 nm和280 nm處吸收值，并計算其濃度和純度。吸取總 RNA 2 μg，按 Invitrogen公司MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成 cDNA，－20℃保存備用。

1.2.5 Real-time PCR 通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)查找人源的 MMP-9、TIMP-1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因，采用Premier5.0軟件設計引物序列(表1)。Realtime PCR檢測 MMP-9、TIMP-1、GAPDH基因表達水平。采用Bio-Rad IQTM5儀進行測定。GAPDH和 MMP-9、TIMP-1的PCR 反應體系均為 20 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μl，cDNA(稀釋 5 倍)1 μl，2 × SYBR premixture 10 μl，用去離子水(ddH2O)補至20 μl。反應條件為95 ℃ 10 min，95 ℃變性15 s，55℃退火1 min，共40個循環。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2.6 Western印跡 取1×106個翼狀胬肉原代細胞在100 mm培養皿中培養24 h，分別以100 μg/ml殼六糖和PBS作用48 h后，收集細胞提取蛋白，取含有50 μg總蛋白的細胞裂解產物進行8%十二烷基硫酸鈉-聚酰氨乙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳后將蛋白轉移到聚氟偏乙烯(PVDF)膜上，用含有5%脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液(TBST)溶液封閉PVDF膜1 h后，加入 TIMP-1(1∶100)和 MMP-9(1∶200)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，二抗稀釋液(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，增強化學發光法(ECL)顯影。

1.3 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行分析，數據資料以s表示，采用χ2檢驗和t檢驗進行處理。

2 結果

2.1 MMP-9在翼狀胬肉中的表達 MMP-9在翼狀胬肉上皮細胞中表達，并且在胞核和細胞質都有表達。在49例翼狀胬肉組織中，19例(38.78%)陽性表達，30例(61.22%)陰性表達。MMP-9陽性表達者年齡〔(65.7±8.2)歲〕與陰性表達者年齡〔(61.3±6.3)歲〕無顯著差異(P＞0.05)。MMP-9陽性表達中女性8例(42.11%)，男性11例(57.89%)(P＞0.05)。同時，陰性表達標本中女性 17例(56.67%)，男性 13例(43.33%)，亦無顯著差異(P＞0.05)。進展型翼狀胬肉占陽性表達標本總數的78.95%。而處于靜止期的翼狀胬肉標本主要集中于MMP-9陰性組(86.21%)。見圖1。

2.2 殼六糖對翼狀胬肉原代細胞遷移能力的影響 殼六糖濃度為 0、10、50、100、500、1 000 μg/ml時，PECs 遷移能力分別為1.02±0.14、0.9 ±0.16、0.7 ±0.08、0.46 ±0.08、0.41 ±0.03、0.42±0.08。10～1 000 μg/ml區間內殼六糖對PECs遷移力的抑制效果表現出劑量依賴性的特點。并且當殼六糖終濃度為1 000 μg/ml時，對PECs遷移能力表現出顯著抑制。

2.3 在PECs中殼六糖對MMP-9、TIMP-1 mRNA水平的影響對照組 MMP-9、TIMP-1 mRNA分別為 1.04±0.11、1.14±0.13，殼六糖處理后的 PECs中 MMP-9 mRNA水平(0.41±0.07)顯著下調，TIMP-1 mRNA水平(2.24±0.19)顯著上調。Western印跡技術檢測同樣發現，殼六糖處理后的 PECs中MMP-9蛋白水平下調，TIMP-1蛋白表達顯著上調。見圖2。

圖1 免疫細化檢測翼狀胬肉組織中MMP-9表達

圖2 Western印跡檢測100 μg/ml殼六糖處理后MMP-9、TIMP-1蛋白水平

3 討論

翼狀胬肉發病機制至今仍不十分清楚，但遷移相關的基因在翼狀胬肉組織中陽性表達暗示遷移可能與其發病有關。殼六糖具有很好的生物活性，在抑制腫瘤發生和惡化方面的表現尤為突出，并且無明顯的毒副作用。Shen等〔3〕在進行胃腺癌細胞系AGS、結腸癌細胞系COLO205、肝癌細胞系HepG2的研究中發現殼六糖具有抑制腫瘤細胞遷移的作用。基于以上幾點，本文開展了殼六糖對翼狀胬肉的研究。到目前為止，翼狀胬肉沒有公認的動物模型，因此以細胞模型作為研究對象，選擇翼狀胬肉病變程度高的組織塊進行原代細胞培養。為避免人為因素的影響，挑選MMP-9(翼狀胬肉發病相關基因)陽性表達的進展型翼狀胬肉組織樣品進行原代細胞培養。本研究發現，當劑量達到100 μg/ml時，殼六糖可有效抑制翼狀胬肉原代上皮細胞(即PECs)的遷移。

MMPs是一類鋅離子依賴的蛋白水解酶，可以水解ECM，在腫瘤細胞的轉移和血管生成等多種病理過程中發揮著重要作用。近來發現，其成員之一的MMP-9在翼狀胬肉中表達，在正常結膜和角膜緣處不表達〔4〕;同時，構成角膜上皮細胞基底膜成分的Ⅳ型膠原可以被MMP-9降解〔4〕。因此，推測殼六糖的作用可能和MMP-9的表達有一定關系。本研究結果表明，殼六糖確實抑制了MMP-9的表達。這與van Quang等〔5〕在人纖維肉瘤細胞HT1080中的發現一致。同時發現，MMP-9主要在遷移能力增強的進展型翼狀胬肉中陽性表達，殼六糖可能通過抑制MMP-9的表達從而具備抑制翼狀胬肉發展的功效。TIMPs是MMPs的主要抑制劑，其中TIMP-1在大部分的翼狀胬肉組織中表達。本研究發現殼六糖可以促進TIMP-1的表達。有報道提到TIMP-1是MMP-9的特異性抑制劑〔6〕。本文的結果似乎表明在PECs上同樣存在這種關系，同時，MMP-9還可刺激血管內皮生長因子(VEGF)的表達。通過對MMP-9和TIMP-1的作用，殼六糖可能不僅抑制基底膜的降解，阻止翼狀胬肉遷移;同時參與抑制一些因子如VEGF(它可引起血管向角膜區長入〔7，8〕)的分泌。這一切都提示殼六糖可用于翼狀胬肉治療。

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2 胡志鵬.殼寡糖的研究進展〔J〕.中國生化藥物雜志，2003;24(4)：210-2.

3 Shen KT，Chen MH，Chan HY，et al.Inhibitory effects of chitooligosaccharides on tumor growth and metastasis〔J〕.Food Chemi Toxicol，2009;47(8)：1864-71.

4 Dushku N，John MK，Schultz GS，et al.Pterygia pathogenesis：corneal invasion by matrix metalloproteinase expressing alteredlimbal epithelial basal cells〔J〕.Arch Ophthalmol，2001;119(5)：695-706.

5 van Quang TA，Kim MM.Inhibitory effect of chitooligosaccharides on matrix metalloproteinase-9 in Human Fibrosarcoma Cells(HT1080)〔J〕.Mar Biotechnol(NY)，2006;8(6)：593-9.

6 Roderfeld M，Graf J，Giese B，et al.Latent MMP-9 is bound to TIMP －1 before secretion〔J〕.Biol Chem，2007;388(11)：1227-34.

7 陳嘉寧，黃巧玲，姜文浩.血管內皮生長因子在堿燒傷角膜新生血管中表達的研究〔J〕.中國老年學雜志，2005;25(9)：1006-8.

8 宋漢君，呂少春，李麗疆，等.紅景天苷的抗腫瘤作用〔J〕.中國老年學雜志，2011;20：3991-2.