白介素-21對細胞毒T淋巴細胞殺傷非霍奇金淋巴瘤的影響

劉紅艷 葉 松 冉昌麗 王海燕 郭靜明

(宜昌市中心人民醫院血液科 三峽大學第一臨床醫學院，湖北 宜昌 443003)

非霍奇金淋巴瘤(NHL)按目前常規的治療方案(如CHOP方案)，約有30% ～40%的病例可長期緩解，但是仍有約60%～70%的患者常規治療失敗和復發，挽救性治療的效果較差。因此迫切需要發現更有效的治療手段和措施。白介素-21(IL-21)是一類新發現的細胞因子，與Th1密切相關，發揮防御腫瘤的作用〔1〕，與其他抗腫瘤制劑聯用還可減少制劑用量，延長患者存活期〔2〕。IL-21還能通過提高細胞毒 T淋巴細胞(CTL)、T淋巴細胞及NK細胞的增殖，增強其殺傷腫瘤的細胞毒作用，同時促進干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α的分泌，增強殺傷細胞的敏感性，從而發揮其免疫增強的作用。本課題通過實驗，說明IL-21能促進CTL增殖而殺傷NHL細胞的作用，為臨床治療提供潛在的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 人非霍奇金淋巴瘤細胞株(Raji)購自同濟醫學院附屬協和醫院血液病研究所，單個核細胞來自健康人外周血。

1.2 主要試劑 RPMI1640，IMDM，FBS購自 Gibco公司，Fi-coll購自武漢御和生物公司，抗CD2磁珠購自Miltenyi公司。TNF-α、IL-21購自Pepro Tech公司。ELISA試劑盒購自Bender公司。TRIZOL為Invitrogen公司產品，逆轉錄試劑盒、Taq DNA和dNTP為Fermentas公司產品，PCR引物由上海生物工程公司合成，DNA Marker購自深圳晶美公司，EDTA及EB為Sigma公司產品，瓊脂糖購自Biowest公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養樹突細胞(DCs)抽取健康人外周血10 ml，肝素抗凝(20 U肝素/1 ml全血)。將全血用RPMI-1640對倍稀釋，充分混勻。向干凈的離心管中加入0.077 g/ml Ficoll-Hypaque細胞分離液10 ml，離心15 min。用吸管取中間的淡黃色單個核細胞層。用Hank's液洗滌2次，棄上清液，用RPMI-1640洗滌1次，離心。調整細胞濃度為2×105/ml，加入磁珠標記的抗CD2單抗于10℃，將細胞混液加入到Mini MACS細胞分離柱中，以IMDM培養基，此即為CD2+的DC細胞。

1.3.2 誘導腫瘤特異性CTL 以含10%FBS、1% 抗生素、GM-CSF(1 000 U/ml)、IL-4(500 U/ml)、TNF-α(1 000 U/ml)的RPMI-1640懸浮細胞，同時加入淋巴瘤細胞凍融抗原50 μl，接種于60 cm2的培養皿中，37℃，5%CO2培養箱中培養。

1.3.3 實驗分組 將此培養液分為對照組和實驗組，實驗組于第7天后加入100 ng/ml的IL-21。14 h后以ELISA法、RTPCR檢測IFN-γ和TNF-α濃度，皆按照試劑盒說明進行。

1.4 統計學分析 數據采用SPSS11.0醫用統計軟件進行分析，計量資料用s表示，采用χ2檢驗進行檢驗分析。

2 結果

2.1 IL-21影響CTL上清中的細胞因子IFN-γ 和TNF-α 經IL-21(100 ng/ml)誘導，CTL細胞14 h上清中IFN-γ的含量為(469.32 ± 2.83)pg/ml，TNF-α 為(82.52 ± 4.72)pg/ml;對照組上清中IFN-γ 的含量為(27.63 ± 2.76)pg/ml，TNF-α 為(11.63±1.54)pg/ml，兩組相比差異顯著(P＜0.05)。

2.2 IL-21影響CTL中 IFN-γ 和 TNF-α 的 mRNA表達 CTL細胞經培養14 h后，分別提取有無IL-21誘導的各組mRNA，測定IFN-γ 和 TNF-α 的 mRNA 表達量(圖 1)。IFN-γ 和 TNF-α的mRNA表達量，均隨著培養的時間延長而減少，見表1。

圖1 IL-21對CTL中IFN-γ和TNF-α mRNA表達的影響

表1 IL-12對CTL中IFN-γ mRNA表達的影響(s)

表1 IL-12對CTL中IFN-γ mRNA表達的影響(s)

與對照組比較：1)P＜0.05

組別 IFN-γ TNF-α對照組40 000±1 100 6 000±154實驗組 4 800±2471) 213±1021)

3 討論

機體的免疫系統能夠識別和清除腫瘤細胞，因此利用自身T淋巴細胞和抗原提呈細胞殺傷腫瘤細胞的細胞免疫治療已經得到廣泛應用。DCs不僅可以有效攝取和提呈腫瘤抗原，而且通過提供活化T細胞所必需的共刺激信號，使T細胞被充分激活和有效增殖。因此，利用DCs提呈腫瘤抗原進而誘導特異性CTL是腫瘤免疫治療的一個熱點。

IL-21主要是由活化后的CD4+T細胞分泌。RT-PCR研究結果顯示在機體正常情況下IL-21的表達量很少，但在模擬T細胞活化的條件下可誘導IL-21的高水平表達，IL-21主要起著廣泛的免疫調節功能。眾多的研究表明，IL-21可以增強腫瘤免疫治療的效果。在用DCs細胞誘導產生的抗自體黑色素瘤CTL中，IL-21可以成10倍增加CTL的增殖及活性〔3〕。IL-21可提高CTL的增殖和增強其殺傷腫瘤的細胞毒作用〔4〕，并促其分泌IFN-γ，IFN-γ可上調腫瘤細胞表面MHC-I類分子的表達，增強對殺傷細胞的敏感性〔5，6〕。在本次研究中，有IL-21實驗組，DC誘導的CTL產生IFN-γ和TNF-α明顯增加，此兩種細胞因子分泌的增加大大提高了CTL對Raji細胞的殺傷作用。證實IL-21促進CTL對Raji細胞殺傷可能部分是通過促使CTL高表達IFN-γ和TNF-α而實現。

1 姚金晶，陳宜濤.Th1/Th2平衡調節與疾病發生的研究進展〔J〕.現代生物醫學進展，2009;9(13)：2597-600.

2 Skak K，Kragh M，Hausman D，et al.Interleukin 21：combination strategies for cancer therapy〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2008;7(3)：231.

3 趙明峰.白細胞介素21——一種新的免疫系統調節因子〔J〕.國際免疫學雜志，2008;31(3)：360-4.

4 van derVliet HJ，Koon HB，Yue SC，et al.Effects of the administration of high-dose interleukin-2 on immunoregulatory cell subsets in patients with advanced melanoma and renal cell cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2007;13(1)：2101-8.

5 Skak K，Kragh M，Hausman D，et al.Interleukin 21：combination strategies for cancer therapy〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2008;7(2)：231-40.

6 Sondergaard H，Frederiksen KS，Thygesen P，et al.Interleukin 21 therapy increases the density of tumor infiltrating CD8+T cells and inhibits the growth of syngeneic tumors〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2007;56(9)：1417-28.