人胎羊膜在促進切口愈合過程中的作用機制

羅秋燕 申素芳 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

胎盤作為一種傳統(tǒng)中藥具有溫腎補精、益氣養(yǎng)血的功效〔1〕。羊膜外敷創(chuàng)面具有透水、透氣及良好的創(chuàng)面黏合力，可以減少創(chuàng)面感染，減輕疼痛，使創(chuàng)面保持一定的濕度，為上皮細胞生長提供一個良好的環(huán)境，加速創(chuàng)面的愈合，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于燒傷、眼科。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是鋅和鈣依賴性內(nèi)肽酶，具有很強的生物學(xué)作用，可降解細胞外基質(zhì)(ECM)中的許多蛋白，在組織修復(fù)、血管形成及組織形態(tài)發(fā)育、創(chuàng)傷愈合過程中扮演重要角色〔2〕。本研究旨在探討羊膜外敷對大鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中創(chuàng)緣周圍MMP-2表達的影響，進一步闡述其促進傷口愈合的機制，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源 新鮮羊膜均來自我院婦產(chǎn)科健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的胎盤，產(chǎn)前血清學(xué)檢查排除艾滋病、乙肝、丙肝、梅毒等傳染性疾病，無污染且羊水澄清的胎盤，將鈍性分離后獲得的羊膜層放入1‰洗必泰溶液中浸泡消毒10 h后，放入無菌密閉容器內(nèi)，保存于4℃冰箱〔3〕。將60只體重300～400 g的健康成年清潔級SD雄性大鼠(由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)隨機分成兩組，每組30只。其中1組為對照組，另1組為羊膜組。每組各設(shè)傷后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d 六個時相點，每個時相點5只。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮膚切創(chuàng)模型的建立 10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉后，背部正中用8%硫化鈉備皮。局部用碘伏、酒精消毒，用無菌手術(shù)刀在背部沿脊柱旁約1 cm處做長約4 cm的縱行切口，深達肌層，創(chuàng)面自然止血后間斷縫合皮膚及皮下組織，對照組用無菌紗布覆蓋切口并包扎，羊膜組將處理過的羊膜直接貼敷在切口表面，紗布覆蓋并包扎。將處理后的大鼠分籠飼養(yǎng)，3 d后換藥，不換羊膜，并于切創(chuàng)后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d分別將兩組大鼠脫頸椎處死。取創(chuàng)口處及周圍1.0 cm×1.5 cm全層皮膚及皮下組織，取材后均放入4%多聚甲醛中固定6 h，脫水、透明、石蠟包埋〔4〕。

1.2.2 免疫組化染色 制作5 μm厚石蠟切片，貼敷于涂有多聚賴氨酸(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)的載玻片上。水浴修復(fù)抗原(抗原修復(fù)液由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗5 min，共3次。正常羊血清孵育。兔抗鼠單克隆抗體MMP-2作為一抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)。生物素-親合素-過氧化物酶復(fù)合物(S-P)法免疫組織化學(xué)染色(北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)均按說明書進行。蘇木素復(fù)染，PBS代替一抗作為陰性對照。未見非特異性染色，另做常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。顯微鏡下按著色深淺及范圍分為：不著色為陰性;部分胞質(zhì)著淡黃色為弱陽性;胞質(zhì)或胞膜大部分著黃色為陽性;胞質(zhì)或胞膜著淺褐黃色為中等陽性;胞質(zhì)或胞膜著深褐黃色為強陽性等5個等級〔5〕。在光學(xué)顯微鏡(40×10)下每張切片隨機取5個測量視野，計數(shù)包括中性粒細胞、單核細胞及血管內(nèi)皮細胞，計算每個視野中陽性細胞數(shù)與三種細胞總數(shù)的比值。

1.3 切口感染評定 參照文獻〔6〕標準判斷，甲級：切口愈合優(yōu)良，無不良反應(yīng);乙級：愈合處有炎癥反應(yīng)，如紅腫、硬結(jié)、血腫，積液多，但未化膿;丙級：切口化膿。乙級、丙級愈合被定性為切口感染。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以s表示，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗;不同時間點兩兩比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組各時間點MMP-2的表達 傷后12 h，羊膜組和對照組均可見MMP-2在大部分中性粒細胞中表達。隨后1 d兩者表達開始逐漸增強，以中性粒細胞為主，可見散在單核細胞表達，部分血管內(nèi)皮細胞也有呈陽性表達。3 d達到高峰，陽性細胞以中性粒細胞為主，部分血管內(nèi)皮細胞及成纖維細胞也呈陽性表達。5 d后在炎性細胞中表達顯著減少，以成纖維細胞為主，呈逐漸下降趨勢。7 d傷口已基本愈合，MMP-2仍有少量表達。兩組在不同損傷時相的表達趨勢基本相同，不同的是創(chuàng)傷12 h、1 d、2 d、3 d 后羊膜組較對照組表達增強，傷后 5 d、7 d 羊膜組與對照組表達無明顯差別。見表1。

表1 各時段MMP-2陽性細胞比例(s)

表1 各時段MMP-2陽性細胞比例(s)

損傷時間 對照組 羊膜組 P值12 h 35.39±1.02 37.11±1.16 ＜0.05 1 d 43.61±1.36 45.54±1.49 ＜0.05 2 d 54.24±1.72 56.86±2.16 ＜0.05 3 d 62.03±2.43 69.69±2.69 ＜0.01 5 d 45.03±1.81 46.66±1.58 ＞0.05 7 d 23.83±1.53 25.00±1.04 ＞0.05

2.2 兩組切口感染率的比較 對照組30只大鼠中出現(xiàn)切口感染10只，感染率為33.3%;羊膜組中切口感染2只，感染率為6.7%，兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

3 討論

損傷后12 h～3 d，炎癥細胞表達MMP-2的意義可能在于促進損傷局部中性粒細胞遷移，參與炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果提示羊膜的生長因子可能誘導(dǎo)激活炎性修復(fù)細胞分泌MMP-2使其表達增高，進一步促使炎性細胞向傷口處轉(zhuǎn)移，加速組織清創(chuàng)，對創(chuàng)面的修復(fù)起著關(guān)鍵作用。

本實驗研究表明，傷后5～10 d持續(xù)穩(wěn)定高水平表達MMP-2，也進一步說明了損傷愈合晚期，高水平表達的MMP-2能進一步增加膠原的合成和沉積;另外，有研究表明MMP-2的表達可以促進MMP-9的表達與活化。這充分表明了愈合創(chuàng)口中以及創(chuàng)口周圍MMP-2的持續(xù)不同水平的表達對血管生成、膠原沉積并增加創(chuàng)口張力均有重要的作用。

胎盤即中藥紫河車，為中醫(yī)學(xué)補益要藥。人羊膜系胎盤的一部分(羊膜的胎兒面)，是一種天然高分子生物材料，具有益氣養(yǎng)血之功效，因可以改善氣血不足狀態(tài)，有助于促進傷口收斂。現(xiàn)代藥理研究表明，其內(nèi)含的糖類和氨基酸能提高機體局部產(chǎn)熱機能，加強局部血液供應(yīng)，改善微循環(huán)，從而補充組織細胞所需的營養(yǎng)〔7〕，提高抗過敏能力，直接促進組織細胞的修復(fù)與再生長。同時，免疫反應(yīng)極低。羊膜含有生物源性刺激素，可促進肉芽組織及上皮生長，加速創(chuàng)面的愈合且瘢痕不明顯。

總之，羊膜類生物敷料來源廣泛，取材方便，易制備，無毒副反應(yīng)，療效滿意，安全無痛苦，易被患者接受，不受條件、氣候限制，是促進創(chuàng)面愈合較為理想的生物敷料。

1 文 亮，屈紀富，劉明華.基質(zhì)金屬蛋白酶3在創(chuàng)傷愈合中作用的實驗研究〔J〕.世界急危重病醫(yī)學(xué)雜志，2007;2：1751-4.

2 劉文忠，恩和吉日嘎拉，康毅敏，等.皮膚創(chuàng)面組織VEGF和MMP-2的表達及意義〔J〕.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009;31：85-7.

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5 Bilic G，Hall H，Bittermann AG，et al.Human preterm amnion cells cultured in 3-dimensional collagen I and fibrin matrices for tissue engineering purposes〔J〕.Am J Obstet Gynecol，2005;193(5)：1724-32.

6 Papadopulos NA，Klotz S，Raith A，et al.Amnion cells engineering：a new perspective in fetal membrane healing after intrauterine surgery〔J〕?Fetal Diagn Ther，2006;21(6)：494-500.

7 朱志軍，徐國士，趙 靜，等.牛羊膜在燒傷創(chuàng)面的臨床應(yīng)用研究〔J〕. 中國修復(fù)重建外科雜志，2006;20(7)：735-8.