金銀花提取物及主要成分對藥物代謝酶CYP3A4的活性抑制作用研究

徐文 孫術紅 劉濤 馬敏 隋忠國

（青島大學醫學院附屬醫院藥學部，山東 青島266002）

藥物的體內轉化依賴于體內的藥物代謝酶。細胞色素P450，又稱為細胞色素P450 混合功能氧化酶系（簡稱細胞色素酶或CYP），是人體內最重要的藥物代謝酶，參與絕大多數藥物和部分內源性物質的體內代謝[1-3]。其中，CYP3A4約占人肝臟中細胞色素酶總量的30%，腸道中細胞色素酶的70%，參與約一半上市藥物的體內代謝[4]。該酶的活性容易受到抑制，導致底物藥物的吸收增加或代謝變慢，加重毒副作用。西藥在研發階段必須考察對藥物代謝酶的誘導和抑制作用，以確保臨床合理用藥[5]；中藥在這方面的研究很少且更易對藥物代謝酶產生影響，因此，為保證臨床安全用藥，有必要研究其對藥物代謝酶的作用[6-7]。

金銀花是一種常用中藥，其提取物及復方制劑在抗菌、抗病毒方面有很強的活性且不易耐受[8-9]，但在臨床使用時多與化學藥物聯用，其中不乏CYP3A4 的底物藥物，如克林霉素、林可霉素、夫西地酸鈉、利福平、克拉霉素等。金銀花是否會導致藥物相互作用還未見報道。本文研究了金銀花提取物及其3 個主要成分（綠原酸、咖啡酸和蘆丁）對CYP3A4 的活性影響，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

金銀花（由本院采購辦公室采購，產地山東，經本院于良生主管藥師鑒定為正品）；rhCYP3A4、1′- 羥基咪達唑侖、葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶, 葡萄糖-6- 磷酸（Sigma 公司）；替硝唑、綠原酸、咖啡酸和蘆丁（原中國藥品生物制品檢定所）；氧化型輔酶Ⅱ（NADP+）（Fluka 公司）；咪達唑侖注射液（江蘇恩華藥業集團有限公司）；乙腈，色譜純（德國Merck 公司）；甲酸，色譜純（美國Tedia 公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

美國Agilent 6410B 三重四級桿液質聯用系統，配有G1311A 四元泵、G1322A 真空脫氣 機、G1329A 自動進樣器和G1316A 柱溫箱，使用Mass Hunter 軟件控制系統及數據處理；色譜柱為美國Agilent ZORBAX SB-C18(3.5 μm，2.1 mm×100 mm)色譜柱。

2 實驗方法

2.1 金銀花提取物的制備

取金銀花100 g 加水1 L 浸漬30 min，煎煮1 h，再加水1 L，煎煮1 h，分次濾過，合并濾液，濃縮至100 mL，放冷至40℃，緩緩加入乙醇使含醇量達75%，充分攪拌，靜置12 h，濾取上清液，回收乙醇至無醇味，加入3 ～4 倍量水，調pH 至7.0，充分攪拌并加熱至沸，靜置48 h，濾取上清液，濃縮至100 mL)，放冷至40℃，加入乙醇使含醇量達85%，靜置12 h，濾取上清液，回收乙醇至無醇味，備用。

2.2 還原型輔酶Ⅱ（NADPH）生成系統的配制

將葡萄糖-6- 磷酸、NADP+和葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶加入到20 mmol/L 氯化鎂溶液中，濃度分別為40 mmol/L、4 mmol/L 和3.2 U/mL。該溶液分裝后置于-20℃備用。

2.3 rhCYP3A4 的孵化

反應體系中先分別加入rhCYP3A4、探針底物咪達唑侖和待測藥物，置于37℃水浴中預孵化5 min，加入NADPH 生成系統啟動反應。在反應體系中，rhCYP3A4、咪達唑侖、NADP+、氯化鎂、葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶、葡萄糖-6- 磷酸的濃度分別為50 nmol/L、5 μmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L、0.8 U/mL 和10 mmol/L。37℃水浴振蕩反應5 min后，加入冰乙腈（含內標替硝唑1 μg/mL）終止反應。渦旋混合1 min，10 000×g 離心5 min，取上清液10 μL 加入液相色譜-質譜聯用（LC-MS/MS）系統測定咪達唑侖代謝產物1′- 羥基咪達唑侖的濃度。

實驗均為雙樣本分析取平均值。每批實驗均設不加待測藥物的陰性對照，即以加入等體積的溶劑替代待測藥物，加入待測藥物后生成的代謝產物的濃度與陰性對照相比，即可估算出待測藥物對藥物代謝酶活性的影響。

2.4 LC-MS/MS 測定1′- 羥基咪達唑侖的色譜和質譜條件

6410B 三重四級桿液質聯用儀（Agilent 公司）；ZORBAX SB-C18柱（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）（Agilent 公司），流動相為乙腈-水-甲酸（40∶60∶0.3），流速0.3 mL/min，柱溫35℃，進樣量10 μL；質譜使用ESI 源，正離子模式，噴霧電壓4 000 V，源溫度105℃；霧化氣為氮氣，霧化壓力40 psi；去溶劑氣為氮氣，溫度350℃，流速10 L/min；碰撞氣為高純氮氣，壓力0.1 MPa；質譜的半峰寬均為0.7 amu。采用多反應監測（MRM）模式對藥物離子濃度進行測定，m/z342.2 →324.2監測1′-羥基米達唑侖,m/z248.2 →121.1 監測替硝唑。

2.5 抑制作用強弱和作用類型判斷

在孵化體系中加入不同濃度的待測藥物，分別求得其抑制率，回歸計算IC50值。藥物對CYP3A4 的抑制作用用1′- 羥基咪達唑侖生成速率的降低來表示，以溶劑對照時1′- 羥基咪達唑侖的生成速率為100%，加入待測藥物后1′- 羥基咪達唑侖的生成速率為剩余活性，本實驗用后者與前者的比值即剩余活性百分率表示藥物對酶活性抑制作用的強弱，數值越低表示抑制作用越強。

抑制作用類型的判斷則采用固定待測藥物濃度（接近IC50值），改變預孵化時間和探針底物加入順序，即先加入待測藥物、NADPH 生成系統分別預孵化5、10、20、30 和60 min 后加入探針底物（咪達唑侖），其余操作不變。如果藥物的抑制作用不受孵化時間的影響則為非抑制作用；如果抑制作用隨孵化時間的延長而增加則為不可逆抑制作用。

3 實驗結果

3.1 不同濃度的金銀花提取物、綠原酸、咖啡酸和蘆丁對CYP3A4 的抑制作用見圖1，其中金銀花提取物的濃度單位mg/mL 是指每毫升中相當于原藥材的質量。

圖1 金銀花提取物（A）、綠原酸（B）、咖啡酸（C）和蘆丁（D）對CYP3A4 的抑制作用量效曲線

由圖1 可見，所測定的金銀花提取物及其3 個主要成分均對CYP3A4 有一定的抑制作用，且隨著孵育體系中藥物濃度的升高，抑制作用增強（CYP3A4 的剩余活性下降）。抑制作用的IC50值分別為2.13 mg/mL（金銀花提取物）、28.8 μmol/L 綠原酸）、74.06 μmol/L（咖啡酸）和17.6 μmol/L（蘆丁）。咖啡酸的抑制作用很弱，幾乎不會導致藥物相互作用，故不進行下一步研究。

3.2 抑制類型判斷

不同預孵化時間對綠原酸和蘆丁抑制作用的影響見圖2。

由圖2 可見，在5 ～30 min 預孵化時間內，綠原酸的抑制作用迅速增加，繼續延長預孵化時間，對酶活性的抑制作用略增加，可見綠原酸對CYP3A4 有不可逆抑制作用；蘆丁對CYP3A4 的抑制作用受預孵化時間的影響與綠原酸類似，也是不可逆抑制作用。

圖2 預孵化時間綠原酸（A）和蘆丁（B）對CYP3A4 的抑制作用的影響

4 討論

藥物對藥物代謝酶的作用包括抑制作用、激動作用、誘導作用和表達下調作用，其中最常發生的抑制作用分為可逆抑制與不可逆抑制，而可逆抑制又包括競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制等[10]。對于可逆抑制，當提高底物藥物的用量時，這種相互作用可部分抵消甚至完全抵消；而對于不可逆抑制，則是藥物代謝酶完全失活，藥物代謝酶作為一種特殊的蛋白質需要機體重新合成才能發揮作用，這個過程需要幾天的時間，所以此類藥物相互作用即使兩藥間隔數天服用也可能發生[11]。

目前對于中藥抑制作用的強弱還沒有公認的判斷依據，本研究暫按化學藥物的抑制作用的判斷標準對藥物相互作用進行預測。一般化學藥物的抑制作用的IC50低于1 μmol/L容易導致藥物相互作用；1 ～10 μmol/L 之間可能會導致藥物相互作用；大于10 μmol/L 不容易導致藥物相互作用。但是對于不可逆抑制，10 ～50 μmol/L 也可能會導致藥物相互作用。由此判斷，綠原酸和蘆丁均有可能導致藥物的相互作用。且這些藥物的抑制作用相加導致發生藥物相互作用的可能性增加。所以，在使用CYP3A4 的底物藥物，如克林霉素、他汀類血脂調節藥物、環孢素等免疫抑制劑時應避免與含有金銀花的藥物聯用；如果必須聯用，應注意這些底物藥物的吸收及毒副作用可能增加，且這種相互作用在停用含金銀花的藥物數天內也有可能發生。

[1] 鐘大放.藥物代謝[M].北京：中國醫藥科技出版社,1996：1-6.

[2] 冷欣夫，邱星輝.細胞色素P450 酶系的結構、功能與應用前景[M].北京：科學出版社，2001：56-57.

[3] Forrester LM，Henderson CJ，Glancey MJ，et al. Relative expression of cytochrome P450 isoenzymes in human liver and association with metabolism of drugs and xenobiotics [J]. Biochem J，1992，281（Pt2）：359-368.

[4] Lin JH，Lu AY. Inhibition and induction of cytochrome P450 and the clinical implications[J]. Clin Pharmacokinet，1998，35（5）:361-390.

[5] Hengstler JG，Bolt HM. Failure in drug development: the role of inhibition and induction of cytochrome P450 enzymes [J]. Arch Toxicol，2008，82（10）:665-666.

[6] Foti RS，Wahlstrom JL，Wienkers LC. Thein vitrodrug interaction potential of dietary supplements containing multiple herbal components[J].Drug Metab Dispos，2007，35（2）：185-188.

[7] Lee LS，Andrade AS，Flexner C. Interactions between Natural Health Products and Antiretroviral Drugs: Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Effects [J]. Clin Infect Dis，2006，43（8）:1052-1059.

[8] 李澤庚，張國梁，尚麗莉，等.中藥注射劑在手足口病中的應用概況[J].中醫藥臨床雜志，2010，22（7）：582-584.

[9] 宋志香，李劉坤，李興廣. 中藥痰熱清注射液治療MRSA 感染性肺炎的臨床觀察研究[J]. 中華醫院感染學雜志，2010，20（11）：1596-1598.

[10] Lim HK，Duczak N Jr，Brougham L，et al.Automated screening with confirmation of mechanism-based interaction of CYP3A4，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，and CYP1A2 in pooled human liver microsomes [J]. Drug Metab Dispos，2005，33 (8)：1211-1219.

[11] Stresser DM，Broudy MI，Ho T，et al. Highly selective inhibition of human CYP3Ain vitroby azamulin and evidence that inhibition is irreversible[J]. Drug Metab Dispos，2004，32（1）：105-112.