轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性花生分離蛋白工藝的研究

熊 柳 孫慶杰 劉 硯 張 磊

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109)

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性花生分離蛋白工藝的研究

熊 柳 孫慶杰 劉 硯 張 磊

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109)

為了改善花生分離蛋白的凝膠特性，研究了利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)改性花生分離蛋白的工藝。在進(jìn)行了酶添加量、花生分離蛋白濃度和酶作用時(shí)間單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了酶交聯(lián)改性的最佳條件。并分別測定了酶改性前后花生分離蛋白的功能性，包括:溶解性、吸油性、持水性、乳化性和乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性。通過響應(yīng)面分析得到酶改性的最佳條件:酶添加量、花生分離蛋白質(zhì)量濃度和酶作用時(shí)間分別為17.75 U/g、29.60 g/mL和376 min，在此條件下，凝膠的硬度可達(dá)到333.49 g。經(jīng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性后，花生分離蛋白的吸油性和持水性均有不同程度的提高，分別提高了27.41% 和 61.24%。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 花生分離蛋白 凝膠性 功能特性

花生是我國重要的油料作物、經(jīng)濟(jì)作物和出口創(chuàng)匯作物，單產(chǎn)、總產(chǎn)、出口量及產(chǎn)值均居世界首位。我國每年能夠生產(chǎn)約220萬噸花生油，同時(shí)產(chǎn)生約300多萬噸花生蛋白粉［1］。花生蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，花生中蛋白質(zhì)是一種很好的植物蛋白，它含有人體所需的8種必須氨基酸，且易為人體消化吸收，并含有比大豆蛋白更少的抗?fàn)I養(yǎng)因子［2］。花生中含有的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，生物價(jià)(BV)為58，蛋白質(zhì)功效比值(PER)1.7，可消化性高，其有效利用率可達(dá)98.4%，比大豆高20%，并且含有人體必需的8種氨基酸［3］。花生中含有比大豆更少的抗?fàn)I養(yǎng)因子，被認(rèn)為是一種極具開發(fā)潛力的乳糖不耐癥消費(fèi)者的蛋白基料和牛乳等動物奶類的替代品。花生蛋白作為病人食品，對幫助糖尿病、高血壓病、動脈硬化癥和腸胃病患者恢復(fù)健康均有一定的效果［4］。

花生分離蛋白(peanut protein isolate，PPI)是一種全價(jià)蛋白類的食品添加劑。可作為優(yōu)良的植物蛋白資源，但天然的花生蛋白本身沒有凝膠特性，因此，在食品加工中的應(yīng)用受到很大限制，如何提高花生蛋白的功能特性，拓寬花生蛋白在食品中的應(yīng)用，發(fā)揮其良好的優(yōu)勢，成為擺在科研工作者面前迫切需要解決的問題。

國外的食品研究者20世紀(jì)50年代就采用各種物理方法、化學(xué)方法、酶法以及基因改造方法處理花生蛋白，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生調(diào)整，從而獲得具有理想的功能特性和營養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)［5］。Fontaine等［6］采用不同的酸(強(qiáng)酸如鹽酸、硫酸、三氯乙酸;弱酸如乙酸、磷酸、一氯乙酸)水解花生蛋白，發(fā)現(xiàn)其理化性質(zhì)變化規(guī)律不同;Beuchat等［7］分別采用胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶水解脫脂花生蛋白，研究其氮溶解性、吸水性、乳化性、持水性、持油性和電泳性質(zhì)的變化。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase，TG)是從微生物中提取的一種能夠催化轉(zhuǎn)酰基反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)(或多肽)之間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)的酶。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是一種優(yōu)良的蛋白交聯(lián)劑，可以催化蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)［8］。在大豆蛋白的制品中，TG酶常被用來提高最終產(chǎn)品的凝膠強(qiáng)度和乳化活力［9－10］。

通過單因素試驗(yàn)研究不同因素對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)改善花生分離蛋白凝膠性的影響，并利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶交聯(lián)改性的最佳條件，并通過測定溶解性、吸油性、持水性、乳化性和乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性，比較酶改性前后花生分離蛋白功能特性的變化，使其達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，對充分利用花生蛋白資源、提高花生蛋白產(chǎn)品附加值具有較重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

低溫脫脂花生蛋白粉:青島長壽食品有限公司;微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(100 U/g):德國AB酶制劑公司。

1.2 主要儀器

TA.XT plus型物性儀:英國Stable Micro Systems公司;SPM－10型pH計(jì):梅特勒－托利多儀器有限公司;723型分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花生分離蛋白的制備

稱取一定量的脫脂花生蛋白粉，按料水比1∶10加入pH 8.5的NaOH 溶液，35℃浸提1.5 h，經(jīng)離心分離除去不溶物，上清液用2.0 mol/L的鹽酸調(diào)至等電點(diǎn)pI=4.8，離心分離后，水洗兩次，干燥、粉碎，過100目篩，即得到花生分離蛋白。

1.3.2 花生分離蛋白的酶解改性工藝

用pH 8.0的磷酸氫二鈉－磷酸二氫鈉緩沖液配制質(zhì)量濃度為25 g/mL分離蛋白溶液，置于60℃水浴鍋中加熱40 min，按15 U/g花生分離蛋白的量添加轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，磁力攪拌10 min，保鮮膜封口，40℃水浴反應(yīng)6 h，90℃滅酶30 min，用冰水迅速冷卻，放入4℃冰箱12 h，取出待恢復(fù)室溫。

1.3.3 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)改善花生分離蛋白凝膠性的響應(yīng)面優(yōu)化

通過單因素預(yù)試驗(yàn)初步確定酶交聯(lián)改性的條件為:花生分離蛋白質(zhì)量濃度30 g/mL，酶添加量15 U/g，酶作用時(shí)間6 h。使用 Design－Expert 7.0.0分析軟件以花生分離蛋白質(zhì)量濃度(X1)、酶的添加量(X2)和酶作用時(shí)間(X3)為試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，見表1。

表1

1.3.4 花生分離蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性TPA的測定［12］

測定前，將待測樣在室溫下放置2 h，制成厚度為30 mm的樣品，用于凝膠測定。采用TA.XT plus物性儀進(jìn)行凝膠質(zhì)構(gòu)特性的測定，主要參數(shù)如下:運(yùn)行模式:Texture Profile Analysis(TPA);測前速度:1.00 mm/s;測試速度:1.00 mm/s;測后速度:1.00 mm/s;形變量為:30.00%;探頭:10 mm圓柱型(P/0.5R)。

以硬度(Hardeness)作為主要指標(biāo)。

1.3.5 花生蛋白功能性質(zhì)的測定

1.3.5.1 溶解性

氮溶解指數(shù)(NSI)的測定:參照 GB/T 5511—1985，糧食、油料檢驗(yàn) 粗蛋白質(zhì)測定法［13］。

1.3.5.2 吸油性［14］

準(zhǔn)確稱取0.5 g蛋白(m)產(chǎn)品于10 mL心管中，加入5 mL(V1)花生油，用玻璃棒攪拌均勻，放置30 min，用5 000 r/min的速度離心30 min，記下游離油的體積(V2)。

吸油性=(V1－V2)/m

1.3.5.3 持水性［15］

向10 g樣品(M)中加入90 mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，80℃恒溫水浴30 min，冷卻到室溫，5 000 r/min離心10 min，去除分離水，測定殘留物的質(zhì)量(m)。

持水性=m/M×100%

1.3.5.4 乳化性與乳化穩(wěn)定性［16］

乳化性:稱取5 g樣品溶于100 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 7.0，加入50 mL花生油，用高速攪拌器攪拌2 min(10 000 r/min)，再離心5 min(5 000 r/min)，記錄離心管中乳化層高度(h)和離心管中液體總高度(H)。按下式計(jì)算乳化性:

乳化性=h/H×100%

乳化穩(wěn)定性:稱取5 g樣品溶于100 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)至pH 7.0，加入50 mL花生油，在高速攪拌器中10 000 r/min均質(zhì)2 min，置于50℃水浴中30 min后，測出此時(shí)的乳化層高度(H0)，并且記錄30 min后的乳化層高度(H1)。則乳化穩(wěn)定性為:

乳化穩(wěn)定性=H0/H1×100%

測定3次取平均值。

1.3.5.5 起泡性與泡沫穩(wěn)定性［17］

按1 mg/100 mL的質(zhì)量濃度將樣品溶解于pH 7.0的10 mmol/L磷酸緩沖液中，取10.0 mL(V0)置于25 mL量筒中，以10 000 r/min的速度均質(zhì)2 min;快速記錄均值停止時(shí)泡沫時(shí)的體積(V1)和放置30 min后各再次記錄泡沫體積(V2)，測定3次取平均值。

起泡性=V0/V1×100%

泡沫穩(wěn)定性=V1/V2×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)改善花生蛋白凝膠性的最佳條件

2.1.1 回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

對花生分離蛋白濃度X1、酶添加量X2和酶作用時(shí)間X3作如下變換:x1=(X1－30)/5，x2=(X2－15)/5，x3=(X3－6)/1。以 X1，X2，X3為自變量，以凝膠硬度為響應(yīng)值(Y)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表1、表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)表 2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用 Design－Expert 6.0.5軟件分析，可得出3個因素和凝膠硬度之間的回歸關(guān)系式:Y=330.87+3.44X1+4.68X2+5.04 X3+0.27X1X2－0.35X1X3－0.16X2X3－12.86X21－5.07X22－9.13X23。

從表3可知，模型 Pr＞F＜0.000 1，表明回歸模型極顯著;失擬項(xiàng)(反映的是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符的情況)的F值為10.40，與整個模型的194.09相比是很小的，這說明不符合的數(shù)據(jù)相對純誤差是不顯著的，因此未知因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾很小;R2=1 743.65/1 750.64=99.60%(因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系)，表明響應(yīng)值(硬度)的變化有99.60%來源于所選變量，即酶添加量、花生分離蛋白濃度和酶作用時(shí)間。因此，該回歸方程對試驗(yàn)擬合情況較好，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。X1，X2，X3，X21，X22，X23為顯著性影響因素，表明各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。所以，可以利用該回歸方程確定最佳酶改性的條件。

2.1.2 相應(yīng)面因素相互作用分析及酶改性最佳條件圖1～圖3直觀地反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極大值，即是響應(yīng)面的最高點(diǎn)，同時(shí)也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)。由此可以得出，酶改性的最佳條件為酶的添加量為17.74 U/g，花生分離蛋白質(zhì)量濃度為29.59 g/mL，酶作用時(shí)間為6.27 h。

在此條件下，預(yù)測凝膠硬度的理論值為332.22 g。

為驗(yàn)證響應(yīng)面分析法所得結(jié)果的可靠性，采用上述最佳條件進(jìn)行酶改性，考慮到實(shí)際操作的條件，酶添加量、花生分離蛋白濃度和酶作用時(shí)間分別設(shè)定為17.75 U/g、29.60 g/mL 和 376 min，結(jié)果表明:在最佳酶改性條件下，凝膠的硬度可達(dá)到333.49 g，比預(yù)測的理論值332.22 g高0.38%。可見該模型較好地反映出轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)改善花生分離蛋白凝膠性的改性條件，從而也證明了響應(yīng)面分析法在確定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)改善花生分離蛋白凝膠性改性條件的可行性。

2.2 酶改性前后花生分離蛋白功能特性

經(jīng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性后，花生分離蛋白的吸油性和持水性均有不同程度的提高，分別提高了27.41%和61.24%(表4);說明轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化導(dǎo)致球狀蛋白的空間結(jié)構(gòu)展開，其二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)逐漸打開，多肽鏈變得舒展，使原先埋藏于分子內(nèi)部的諸多疏水區(qū)域暴露于溶液，從而增加其吸油性［18］。同時(shí)，一方面形成的交聯(lián)鍵使蛋白質(zhì)形成復(fù)雜的、嚴(yán)密的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對水分的包容束縛能力增強(qiáng);另一方面谷氨酰胺脫酰胺，進(jìn)一步使氨基酸側(cè)鏈的親水性增強(qiáng)。這兩種變化都有可能導(dǎo)致蛋白持水能力增加。

表4 酶改性前后花生分離蛋白的功能特性

但其溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性均有所下降，分別降低了 17.78%、26.51%、10.93%、56.18%和 9.38%(表 4)。

說明轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶能夠催化蛋白導(dǎo)致其分子內(nèi)及分子間其發(fā)生交聯(lián)，隨著酶反應(yīng)時(shí)間的延長，蛋白交聯(lián)程度增加，形成分子質(zhì)量較大的聚合物，進(jìn)而從溶液中析出而沉降，導(dǎo)致溶解度降低。同時(shí)蛋白表面疏水性和溶解性下降綜合作用的結(jié)果，導(dǎo)致花生分離蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性下降［19］，結(jié)果與張春紅等［20］相似。

花生分離蛋白溶液受到急速機(jī)械攪拌時(shí)，會有大量氣體混入，形成水－空氣界面，同時(shí)蛋白分子間的相互作用促進(jìn)界面膜(保護(hù)膜)的形成，適當(dāng)?shù)慕宦?lián)能使界面膜得以加強(qiáng)，增加蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，但較高的交聯(lián)度(反應(yīng)程度)反而會破壞這種界面膜的形成，從而降低起泡性和泡沫穩(wěn)定性［21］。

3 結(jié)論

3.1 通過單因素試驗(yàn)初步確定酶交聯(lián)改性的條件并在此基礎(chǔ)上，以凝膠硬度為主要指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面分析法中的Box－Behnken模式，通過二次回歸設(shè)計(jì)優(yōu)化酶交聯(lián)改性的最佳條件:酶添加量、花生分離蛋白質(zhì)量濃度和酶作用時(shí)間分別為17.75 U/g、29.60 g/mL和376 min;結(jié)果表明:在最佳酶改性條件下，凝膠的硬度可達(dá)到333.492 g，相對誤差僅為0.38%。說明所得回歸模型擬合情況良好，結(jié)果可靠。試驗(yàn)所得TG改性后花生分離蛋白能夠形成凝膠，且具有較高的凝膠性能，可以添加到肉制品中用來改進(jìn)產(chǎn)品的質(zhì)地結(jié)構(gòu)，也可在酸奶加工中添加提高酸奶黏度。

3.2 花生分離蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)改性后，其吸油性和持水性均有不同程度的提高，分別提高了27.41%和 61.24%。

［1］吳海文，王強(qiáng)，馬鐵錚.不同制備方法對花生蛋白功能性質(zhì)的影響［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009，25(4):304－305

［2］談佳玉，王承明.響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備花生蛋白的工藝研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2011，26(8):100－104

［3］李曉東，李曉梅.花生營養(yǎng)功效及花生蛋白乳飲料工藝研究［J］.科技信息:科學(xué)教研版，2007(29):47

［4］周雪松，趙謀明.我國花生食品產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(6):84－89

［5］鄭紅艷，鐘耕.花生蛋白改性研究及開發(fā)前景［J］.糧食與油脂，2009(1):14－16

［6］Fontaine N，Takazawa T，Tanaka T.Site－ specificcross－linking of functional proteins by transglutamination［J］.Enzyme and Microbial Technology，2003，33:492 －496

［7］Beauchat L G，Whitehead J，Kinsella J.Structure function properties of food proteins［M］.New York:Academic Press 1991:104－136

［8］Christensen B M，Sorensen E S.Localization of potential transglutaminase cross － linking sites in bovine caseins［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44(7):1943－1947

［9］吳瓊，陳麗娜，代永剛，等.響應(yīng)面優(yōu)化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性大豆分離蛋白工藝［J］.食品科學(xué)，2011，32(4):7－9

［10］祖海珍，徐幸蓮，魯奕俊，等.不同熱處理溫度下轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對混合蛋白凝膠性的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，21(3):185 －190

［11］熊柳，孫高飛，孫慶杰，等.花生蛋白粉凝膠性改善研究［J］.食品科學(xué)，2009，30(13):113 －115

［12］GB/T 5511—1985 量和單位［S］

［13］孫冰玉，石彥國.微波對醇提大豆?jié)饪s蛋白吸油性的影響［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2006，6(5):97－99

［14］Beuchat L R.Functional and electrophoretic characteristics of succinylated Peanut flour proteins［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1977，25:258

［15］Pearce K N，Kinsella J E.Emulsifying properties of proteins:Evaluation of turbidiment ric technique［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1978，26:716 － 723

［16］Madhusudhan K T，Narendra S.Effect of heat treatment on the functional properties of linseed meal［J］.Agriculture Food Chemistry，1985，33:1223 －1226

［17］管驍，姚惠源，張鳴鏑.燕麥麩分離蛋白的酶解對其功能性質(zhì)的影響［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2006，22(11):217－222

［18］王述輝，張東杰，王昊，等.超聲酶法對大豆分離蛋白乳化性的影響［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2011(1):54－56

［19］張春紅，宣焱.谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶改性對花生分離蛋白某些功能性質(zhì)的影響［J］.食品工業(yè)科技，2009(4):190－193

［20］趙國華，施樹.胡麻籽分離蛋白的溶解性與起泡性研究［J］.食品科學(xué)，2009，30(9):95 －97.

Study on Modification of Peanut Protein Isolate with Transglutaminase

Xiong Liu Sun Qingjie Liu Yan Zhang Lei
(College of Food Science ＆ Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109)

This article focused on investigating the technology of improving the properties of peanut protein iso-late(PPI)gels by cross linking modification with transglutaminase.Effects of enzyme addition amount，PPI concentration and enzyme reaction time on gel strength of peanut protein isolate modified with transglutaminase(PPIMT)were studied by single factor experiment，optimizing the optimum conditions of transglutaminase modification by response surface methodology(RSM).The functionality of PPI were measured before and after modification，including solubility，oil absorption capacity，water capacity，emulsifying capacity and emulsion stability，foamability and foam stability.According to the principle of central－composite design，the hardness was taken as an index to study the effects of PPI concentration，enzyme addition and enzyme reaction time on the gel properties of PPIMT.The RSM analysis showed when PPI concentration，enzyme addition and enzyme reaction time were 17.75 U/g，29.60 g/mL and 376 min respectively，the hardness of PPIMT gel achieved the maximum 333.492 g.Comparing with PPI，the functional properties of PPIMT had been improved.The oil absorption capacity and the water capacity were increased by 27.41%and 61.24%respectively.

transglutaminase，peanut protein isolate，gel properties，functional property

TS202.3

A

1003－0174(2012)04－0044－06

青島市公共領(lǐng)域科技支撐計(jì)劃(11－2－3－25－nsh)

2011－07－14

熊柳，女，1975年出生，碩士，講師，糧食、油脂與蛋白質(zhì)工程

孫慶杰，男，1970年出生，博士，教授，糧食、油脂與蛋白質(zhì)工程