注射用鹽酸克林霉素細菌內毒素的檢查方法

李 琳

（岳陽市長煉醫院藥劑科，湖南 岳陽 414012）

注射用鹽酸克林霉素是一種治療因為中度或者重度感染鏈球菌和葡萄球菌屬及厭氧菌所引起的疾病的抗生素藥物，臨床上主要用于治療呼吸系統感染、皮膚軟組織感染、心內膜炎、中耳炎及敗血癥等疾病。細菌內毒素檢查法的特點主要是成本低、操作簡單、靈敏度高等顯著的特點，為了實現檢查方法的簡單、精確、快速、成本低，筆者按照《中國藥典》（二部）2010年版中對細菌內毒素檢查法及2010年版《中國藥品檢驗標準操作規范》對細菌內毒素檢查法的操作要求等，通過一系列的對比試驗，探討不同廠家和不同批號的鱟試劑對于不同藥物制造企業生產的鹽酸克林霉素細菌內毒素檢查結果的影響作用及其重要性，對此制劑進行細菌內毒素檢查法的可行性及具體的方法研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

南陽普康藥業有限公司生產的注射用的Hydrochloric acid with colin，批號為2009011621、2009011721、2009011821；中國藥品生物制品鑒定所生產批號為150601～201069規格為120EU的細菌內毒素工作標準品（CSE）；鱟試劑1（TAL1）湛江博康海洋生物有限公司生產的批號為1004172，標示靈敏度為0.25EU/mL，規格0.5mL；鱟試劑2（TAL2）由湛江安度斯生物有限公司生產的規格一樣批號為1005282；細菌內毒素檢查用水由中國藥品生物制品檢定所提供的規格為10mL，批號為W2010—1。

1.2 方法

1.2.1 供試品Bacterial endotoxin限值（L）的確定

本品在臨床用藥按照“1h內藥量的輸入不能＞1.2g”計算，根據公式L=K/M，其中M為每kg重量每小時的最大劑量，人均體質量按照60kg計算，由此可以得出L=0.25EU/mg；鱟試劑靈敏度復核試驗 根據2010版《中國藥典》（二部）附錄XIE對本試驗中所采用的兩個不同廠家生產的鱟試劑進行標示靈敏度的復核；并計算供試品的有效濃度。

表1 鹽酸克林霉素干擾試驗結果

1.2.2 干擾試驗預試驗和試驗

用BET用水溶解精密稱量的供試品，并進行倍比稀釋，制成7個濃度的系列溶液，作為供試品的陰性對照，同時制備含Bacterial endotoxin標準品溶液的陽性對照系列溶液，用鱟試劑進行干擾預試驗。按照檢查的要求，使用兩個不同廠家的鱟試劑對濃度為12.5、6.25、3.125的供試品進行干擾試驗。取BET用水和供試品稀釋液把同一支細菌內毒素工作標準品制作成2.0、1.0、0.5、0.25λ的溶液，每個濃度作4管，用BET和供試品稀釋液作陰性對照。

1.2.3 細菌內毒素的檢查

根據2010版《中國藥典》（二部）附錄XIE，參照干擾試驗結果和擬定的內毒素限值，對3個批號、濃度為0.5mg/mL的鹽酸克林霉素進行檢查。

2 結 果

2.1 干擾試驗結果

根據計算可以擬定內毒素的限值L=0.5EU/mg，鱟試劑靈敏度在0.5～2.0λ，符合規定，供試品最大濃度=2mg/mL，最小濃度=0.015mg/mL，干擾預試驗顯示在鹽酸克林霉素濃度≤6.0mg/mL時鱟試劑和細菌內毒素無干擾反應。干擾試驗結果顯示在2.0λ呈陽性，0.25λ呈陰性，對照組呈陰性，Hydrochloric acid with colin濃度≤6.0mg/mL時鱟試劑和細菌內毒素無干擾反應。結果見表1。

2.2 細菌內毒素檢查結果

陰性對照管和供試品管結果都為陰性，陽性對照管和供試品陽性對照管結果均呈陽性，經過檢查，3個批號的供試品均符合規定，結果見表2。

表2 鹽酸克林霉素細菌內毒素檢查結果

3 討 論

3.1 影響內毒素檢查準確性的因素[6]

3.1.1 在檢查操作中，要嚴格的遵循無菌操作的規定，防止微生物污染試劑。實驗室要保持潔凈，所用的器皿必須要洗滌干凈，避免外源性內毒素影響試驗的結果。在試驗中，一定要嚴格的按照規定，保持合適的pH值，避免破壞微量的內毒素。

3.1.2 Bacterial endotoxin的迭加。試驗中使用的一些材料和細菌內毒素檢查用水都可能會存在微量的內毒素，一般都不會超過鱟試劑的靈敏度，不能被檢查出來，但是，它可以增加供試品中內毒素的含量，讓其剛好超過靈敏度限值之上，引起陽性反應。在實際檢查過程中“假陽性實驗”是不能完全避免的，但是可以采取一定的措施來防止其影響，如采用比供試品內毒素限值更小的鱟試劑來檢查或者其他材料等。

3.1.3 結果判定。細菌內毒素檢查必須保證陰性對照溶液均為陰性，供試品陽性，對照溶液和陽性對照溶液結果均為陽性，試驗才為有效。供試品溶液管均為陰性，判供試品符合規定，反之則判供試品不符合規定。若有一管為陰性，另一管為陽性，需進行復試。復試時供試品溶液需做4支平行管，若均為陰性，判供試品符合規定，否則判供試品不符合規定。

3.2 是否能妥當的確定一個新品種的內毒素限值，直接關系和決定了藥物本身所允許的內毒素含量標準質量的評價，標準要求太高，目前的技術水平沒有達到要求，生產出來的產品通不過檢查，就會導致資源的不必要浪費，標準要求太低，又不能保證藥品的質量，導致很多臨床用藥的安全問題，危及到人身的安全[3]。試驗結果表明注射用鹽酸克林霉素采用細菌內毒素檢查法代替Pyrogen test是有效且可行的，供試品在稀釋濃度≤6.0mg/mL，靈敏度為0.25EU/mg時內毒素與鱟試劑無干擾反應，可以進行內毒素檢查，是有效可行的控制辦法。

[1]劉雪莉,張敏,李曉利,等.注射用鹽酸克林霉素細菌內毒素檢查方法[J].中國藥業,2011,20(21):32-33.

[2]沈春燕,馮婧,陳益,等.注射用鹽酸克林霉素的細菌內毒素檢查[J].海峽藥學,2009,22(4):77-78.

[3]嚴曉明,江蘭英,王莉蓓,等.鹽酸克林霉素氯化鈉注射液中細菌內毒素定量檢查(動態濁度法)方法的研究[J].中國藥事,2005,19(10):610-612.

[4]雷福年.鹽酸克林霉素氯化鈉注射液細菌內毒素檢查法的建立及方法學研究[J].海峽藥學,2008,20(7):65-67.

[5]張義偉.細菌內毒素檢查的幾點體會[J].中國實用醫藥,2010,5(3):86-87.

[6]范能全,彭蘭.細菌內毒素的檢查及干擾因素的排除[J].中國藥師,2007,10(9):915-916.

[7]Li Zhang,Huiping Hu,Zhi Liao,et al.Hydrochloric acid leaching behavior of different treated Panxi ilmenite concentrations[J].Hydrometallurgy,2011,107(1/2):40-47.

[8]Singh, A.,Ahamad, I.,Singh, V.K,et al.Inhibition effect of environmentally benign Karanj (Pongamia pinnata)seed extract on corrosion of mild steel in hydrochloricacidsolution[J].J Solid State Electrochem,2011,15(6):1087-1097.