正交設計優選冰片脂質體的制備工藝

羅 懿 李 珊 歐陽榮* 任衛瓊 萬艷群

（1 湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410007；2 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

冰片具有清熱解毒、防腐生肌、抗菌消炎的作用，廣泛用于外用制劑，大多皮膚瘙癢癥患者會有抓傷、發紅、發熱的現象，涂上含有冰片的藥物皮膚有涼感，既可緩解局部癥狀又可抗菌消炎、修復皮膚，但冰片具有揮發性，藥效不能持續，近年來，脂質體（1iposome）以其良好的生物相容性、生物膜相似性、無毒和促進藥物透皮吸收、在皮膚內形成藥物儲庫而維持較恒定的有效濃度等特性引起人們的高度重視。因此，本實驗以薄膜超聲法制備冰片脂質體，將部分冰片用脂質體包裹，以此減少冰片揮發并延緩冰片釋放，最終，延長藥物作用時間，提高藥物療效。

1 儀器與藥品

天美氣相色譜儀（上海天美科學儀器有限公司）；高壓均質機（意大利NIR0?SOAⅥ公司）；Mastersj-zer2000激光粒度測定儀（英國Malvem公司）；RE-52c旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；80-2型離心機（上海浦東物理光華儀器廠）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ES-J120型電子分析天平（湖南光明電源）；TEM-100CXⅡ透射電鏡（日本電子公司）；冰片購自湖南三湘中藥飲片公司，批號：20110710，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科藥檢室鑒定均符合2010年版《中華人民共和國藥典》規定；冰片對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110743-200905）；膽固醇（北京市海淀區微生物培養基制品廠，批號：20101129）；大豆卵磷脂（北京華清美恒天然產物技術開發有限公司，批號：20100523）；羧甲基纖維素鈉（上海山浦化工有限公司，批號：20110729）；水為二次蒸餾水；試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 冰片的含量測定[1、2]

2.1.1 色譜條件

石英毛細管柱（HP-INNDWAX，30 m×250 μm，0.25 μm）；氫火焰離子化檢測器；柱溫：140℃；檢測器溫度：250℃；進樣口溫度：200℃；載氣（N2）1.0 mL/min；空氣（Air）400 mL/min；氫氣（H2）40 mL/min；分流進樣，進樣量：1.0 μL ；分流比為6∶1。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取冰片對照品31.2 mg,置于10 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成3.12 mg/mL的對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密移取樣品4.0 mL在10000 r/min的離心機中離心30 min，取上層液測游離藥的含量，并記錄上層液體積，將下層沉淀用3.0 mL無水乙醇破膜，然后在5000 r/min的離心機中離心 15 min，取上層液測含量并記錄上層液體積。

2.1.4 標準曲線的繪制

精密移取對照品儲備液10.0、7.5、5.0、2.5、0.5、0.25 mL分別置于10 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻，0.45μm濾膜過濾，取續濾液依次進樣1.0 μL，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=7044.6X+116.67，r=0.9996，表明冰片在0.014～0.554 μg呈良好線性關系。

2.1.5 精密度實驗

精密移取對照品溶液1.0 μL，重復進樣6次，測得冰片質量濃度的RSD 2.0%。

2.1.6 穩定性試驗

分別精密移取1.0 μL供試品溶液于0、1、2、3、4、7 h后注入氣相色譜儀，測得冰片質量濃度的RSD 1.30%，表明供試品溶液在7 h內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗

按2.1.3操作制備供試品溶液，依法測得冰片的平均包封率為89.7%，RSD為1.5%。

2.1.8 加樣回收率試驗

取9份1.0mL的空白脂質體，分為3組，分別加1.6 mL、2.0 mL、2.4 mL的對照品儲備液，每一份再加1.0mL無水乙醇破膜，搖勻，離心，分別得2.39、2.40、2.37；3.38、3.36、3.39；3.90、3.96、3.92 mL上清液，按2.1.1項下測含量，結果三種濃度的平均回收率為101.56%，RSD為2.67%。

2.2 脂質體的制備[3、4]

2.2.1 正交實驗及結果

在參考相關文獻及預試驗的基礎上，擬用薄膜超聲法來制備冰片脂質體，選擇對包封率影響較大的以下3個因素：水化溶液PBS用量A（mL），卵磷脂與膽固醇的質量比B（mg/mg），藥脂比C（mg/mg），每個因素選擇3個水平，按正交試驗設計表，進行L9（34）優化試驗。因素水平見表1，正交試驗結果見表2、方差分析見表3。

表l 因素水平表

表2 L9（34）實驗設計表

表3 方差分析表

根據綜合評分的極差R值可以看出，影響因素的排序為C＞A＞B，從K值和直觀比較，得出理論最佳工藝條件為A2B1C3，最終確定的最佳脂質體制備工藝條件為卵磷脂300.0 mg，膽固醇50.0 mg，冰片25.0 mg，PBS 20 mL。其中藥物與卵磷脂的比例影響最顯著。

2.2.2 冰片脂質體的制備工藝

精密稱取卵磷脂 300.0 mg，膽固醇 50.0 mg，置于500 mL圓底燒瓶中，加入35 mL二氯甲烷使成均一混懸液，將圓底燒瓶置于旋轉蒸發儀中，40℃恒溫水浴，轉速為100 r/min，減壓條件下蒸除二氯甲烷，使膜材在瓶壁上形成均勻的類脂薄膜，將25.0 mg冰片用2 mL無水乙醇溶解倒入20 mLPBS（PH 6.8）中，再加入一滴吐溫-80，將其混合液倒入具有類脂薄膜的的圓底燒瓶中，在50℃浴式超聲儀中超聲5min，得稀乳狀的脂質體懸液，將其在高壓均質機上，90.3KPa壓力下循環12次，置棕色瓶中密閉保存。

2.2.3 驗證實驗

按優選處方：卵磷脂300.0 mg，膽固醇50.0 mg，冰片25.0 mg，PBS 20 mL平行制備3批冰片脂質體，測得包封率分別為89.5、89.2、90.3。驗證試驗結果表明該制備工藝穩定。

2.3 冰片脂質體的質量評價[5，6]

2.3.1 顯微觀察

將稀釋后的脂質體懸液，點樣于銅網上，用2%的磷鎢酸負染，用濾紙吸干染液，然后用透射電子顯微鏡觀察并拍照，可見脂質體輪廓清晰，呈類圓形或橢圓形，為大單室脂質體，隱約可見脂質體雙層結構，結果見圖1。

圖1 冰片脂質體電子顯微鏡照片

2.3.2 粒徑與粒度分布

冰片脂質體混懸液用 Mastersizer 2000激光粒度測定儀進行粒度分布測定，粒徑集中分布在50～120 nm內。

2.3.3 包封率的測定[7]

采用高速離心法測定包封率，精密吸取所制備的脂質體混懸液4.0 mL在10000 r/min的離心機中離心30 min，取上層液測游離藥的含量，并記錄上層液體積，將下層沉淀用3mL無水乙醇破膜，然后在5000 r/min的離心機中離心15 min，取上層液測含量并記錄上層液體積。包封率E=W1/（W1+ W2）×100%（W1：包封在脂質體內的藥物的量；W2：未被包封的游離藥物的量）。

3 討 論

3.1 薄膜超聲法制備脂質體，在用旋轉蒸發儀去除二氯甲烷過程中，水浴溫度應控制在40℃以下，溫度太高形成的薄膜不均勻而且超聲時不易脫離瓶壁；超聲時，超聲儀中的溫度也不宜太高，太高的溫度冰片容易揮發。

3.2 為了增加潤膚止癢脂質體凝膠劑的稠度，改善其涂展性，制備脂質體時，在PBS中加了一滴吐溫-80。

3.3 在預試驗中用微型柱離心法測包封率誤差很大，所以選擇高速離心法測包封率較穩定，但一種更科學更先進的測包封率的方法有待于進一步研究。

[1]陳在敏.氣相色譜法檢測麝珠明目滴眼液中冰片和麝香酮的含量[J].海峽藥學,2011,23(3):54-56.

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[4]張揚,趙晶麗.水楊酸脂質體凝膠劑的制備工藝研究[J].西北藥學雜志,2012,27(2):150-152.

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[7]張莉,亓向榮,張春霞.胰島素脂質體藥物含量及包封率的測定[J].中國藥師2010,13(3):364-365.