HPLC法測定創傷愈合藥噴霧劑中血竭素的含量

陳振振，張靈英，李 莉，殷中瓊，張 強，李 開

(1.四川農業大學動物醫學院，四川雅安 625014;2.四川農業大學生命理學院，四川雅安 625014)

血竭、乳香、沒藥等為中國傳統醫學中治療皮膚瘡瘍和創傷的常用藥，常單用或配伍用，其臨床療效已被肯定［1-2］，《本草綱目》記載這些藥物具有收斂止血、活血化瘀、消腫止痛、解毒斂瘡、祛腐與潤膚生肌等作用。《大明本草》記載“治一切惡瘡疥癬久不合者”，故血竭為最常用的生肌之藥，諸家生肌方均不離此藥［3-4］。乳香和沒藥常配伍使用，但乳香以活血散腫止痛為主，而沒藥以消腫止痛生肌為主［3］。現代藥理研究表明油樟葉揮發油具有抗菌、鎮痛和抗炎作用［5］。為了研制對皮膚創傷具有抗菌、抗炎、鎮痛和收斂止血及祛腐與潤膚生肌作用的外用藥物，在實驗室前期研究中將血竭素、乳香揮發油、沒藥揮發油、油樟葉揮發油幾味具有上述功效的藥物組成復方，制備成創傷愈合藥噴霧劑［6］，臨床上擬用于治療動物的皮膚創傷、潰爛、感染等疾病。處方中血竭素的含量為其重要控制指標之一，據報道血竭素的含量測定方法有薄層掃描法［7］、高效液相色譜法［8-9］。為了控制該噴霧劑的質量，保證臨床療效，本試驗采用HPLC法對制劑中的主要活性成分之一血竭素進行含量測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 島津 SH MADZU LC-2010C HT(CLASS-VP 6.13 multi)高效液相色譜儀(島津國際貿易上海有限公司);JD100-3電子分析天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司);雙頻數顯臺式清洗器(上海科導超聲儀器有限公司);SZ-BⅢ型三重純水蒸餾器(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.1.2 藥物與試劑 血竭素高氯酸鹽對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110811-200704);創傷愈合藥噴霧劑(四川農業大學動物醫學院藥學系自制，批號 120308、120309、120310、120311、120312、120313);實驗用甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純;水為三重蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為 Kromasil C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);乙腈 -0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液(50∶50)(用磷酸調pH為3.5)為流動相;檢測波長440 nm，柱溫40℃，流速1.0 mL/min，進樣量為20 μL。理論板數按血竭素計算不得低于4000。

1.2.2 溶液的制備 對照品溶液的制備：精密稱取血竭素標準品(高氯酸鹽血竭素)9.0 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加入3%磷酸甲醇溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻得濃度為0.1307 mg/mL(以血竭素計算)的對照品儲備液。精密量取上述溶液2 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得每毫升中含血竭素26.14 μg(血竭素重量=血竭素高氯酸鹽重/1.377)。

供試品溶液的制備：精密量取創傷愈合藥噴霧劑1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻后即得供試品溶液，貼標簽放置備用。

陰性對照溶液的制備：取只含輔料的空白噴霧

劑作為陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

1.2.3 線性關系的考察 精密吸取制備好的對照品(13.07、19.61、26.14、32.68、39.21、45.74 μg/mL)分別進樣 20 μL，依法測定，記錄峰面積(S，以血竭素峰計，以下相同)。以濃度(C，μg/mL)為橫坐標，峰面積(S)為縱坐標，進行線性回歸。

1.2.4 精密度試驗 精密量取同一血竭素對照品溶液20 μL(26.14 μg/mL)，在 1.2.1 項中的色譜條件下重復進樣6次，記錄血竭素峰面積，考察儀器精密度。

1.2.5 穩定性試驗 在1.2.1項中的色譜條件下，精密吸取對照品儲備溶液 20 μL，于 0、2、4、8、16、24 h各進一次樣，進行測定。

1.2.6 空白試驗 按處方比例和工藝，制成不含血竭素的空白創傷愈合藥噴霧劑，精密量取1.0 mL空白溶液，置入10 mL容量瓶中，在1.2.1項中的色譜條件下進行測定，重復3次。

1.2.7 加樣回收試驗 取已知含量的不同批樣品(批號 120308、120309、120310、120311、120312 和120313，含血竭素分別為 0.0192、0.0188、0.0191、0.0188、0.0192、0.0190 mg/mL)6 份，精密量取 1.0 mL，分別置于6個10 mL棕色容量瓶中，分別加入精密量取的2×10-2mg/mL血竭素高氯酸鹽甲醇溶液1.0 mL，用甲醇定容。將此6份溶液在1.2.1項中的色譜條件下測定，測定各峰面積后帶入回歸方程分析。

1.2.8 樣品含量的測定 精密吸取制備好的6份供試品溶液20 μL，分別進樣，每份重復測定3次，取平均值為噴霧劑中血竭素的含量。

2 結果

2.1 方法的專屬性研究 分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL，在1.2.1項中的色譜條件下，供試品中血竭素色譜峰與對照品色譜峰保留時間一致，并與雜質峰分離度大于1.5，且陰性樣品在相應的位置上無色譜峰干擾(圖1～圖3)。

2.2 線性關系的考察 線性關系考察結果得回歸方程為：Y=6 × 107X-1.5 × 105，r=0.9997(n=6)。結果表明血竭素濃度在 13.07 ～45.74 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.3 精密度試驗 精密吸取同一血竭素對照品溶液20 μL，在1.2.1項中的色譜條件下連續進樣6次，血竭素平均峰面積值為 2276094，RSD為0.76%(n=6)。結果表明重復性良好，儀器精密度符合要求。

2.4 穩定性試驗 在1.2.1項中的色譜條件下，精密吸取對照品溶液，分別于 0、2、4、8、16、24 h 進樣20 μL，測定峰面積，在24 h內血竭素的平均峰面積值為2275864，RSD 為0.48%(n=6)，表明試驗穩定性良好。

2.5 加樣回收試驗 取已知含量的不同批樣品(批號 120308、120309、120310、120311、120312 和120313，含血竭素分別為 0.0192、0.0188、0.0191、0.0188 、0.0192、0.0190 mg/mL)6 份，精密量取1.0 mL，分別加入精密量取2×10-2mg/mL血竭素高氯酸鹽甲醇溶液1.0 mL，按供試品溶液的制備方法操作，分別進樣20 μL，測定其峰面積并計算加樣回收率，平均回收率為98.29%，RSD為0.67%(n=6)(表1)。

2.6 樣品含量測定 取不同批次樣品各2份，按供試品溶液制備方法制備，分別進樣20 μL，每次重復測定3次，測得噴霧劑中血竭素的平均含量為0.01902 mg/mL(表2)

3 討論

血竭素為色原酮類化合物，性質不穩定，見光易分解，在操作過程中應盡量避免強光直射，并用3%磷酸甲醇作為溶劑，使樣品中的血竭素轉變為血竭素的磷酸鹽，增強其穩定性。HPLC法測定血竭素的含量應注意色譜柱條件，保證柱溫。一般來說柱溫升高會降低柱壓，樣品的保留時間會提前;柱溫不恒定，對樣品峰寬的影響比較明顯。

表1 加樣回收實驗結果

表2 樣品含量測定結果(n=6) mg/mL

本研究按照《中國藥典》中規定的方法進行操作，使用乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(50∶50)作為流動相時能夠將血竭素與雜質峰完全分離，且峰形好、柱效高。研究所確定的創傷愈合藥噴霧劑中血竭素含量的測定方法，具有結果準確可靠、方法簡便的優點，可以作為噴霧劑質量控制的依據之一。

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