NK細胞上清液提高CTL細胞對腫瘤細胞殺傷力及機制的研究

余少鴻，湯榮春，Per H Basse

（1.云南省昆明市第一人民醫院普外科 650011；2.美國匹茲堡大學腫瘤中心，匹茲堡PA 15213－1863）

細胞免疫在腫瘤免疫中發揮著重要的作用，其中自然殺傷細胞（NK細胞）及細胞毒性T細胞（CTL細胞）是體內主要的免疫細胞[1]。有研究表明，組織相容性抗原Ⅰ類（MHCⅠ）限制性導致CTL細胞不能有效殺滅腫瘤細胞。下調腫瘤細胞表面人類白細胞抗原（HLA）是腫瘤細胞逃逸CTL細胞重要原因之一[2]。MHCⅠ類抗原部分或全部缺失是黑色素瘤對CTL細胞不敏感因素之一[3－4]。NK細胞可直接殺傷血液循環的腫瘤細胞及腫瘤組織[5]，并且對黑色素瘤肺轉移細胞也有殺滅作用[6－8]。細胞因子白細胞介素2（IL－2）、IL－12和IL－18可增強其殺傷及分泌功能[9]。因此，現將本研究NK細胞上清液提高CTL細胞對腫瘤細胞殺傷力及機制報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與腫瘤細胞 選擇匹茲堡大學腫瘤中心Jackson實驗室無菌環境飼養的C57BL／6雌性裸鼠，8～12周齡，體質量20～30 g；M05黑色素瘤細胞由Per H Basse實驗室保存培養，于RPMI1640液中常規培養。

1.2 NK及CTL細胞表型檢測 從C57BL／6裸鼠提取出脾臟，磨碎，使之成單細胞懸液；1 200 r／min，離心5 min；溶解紅細胞3 min，再離心，過濾，制成脾細胞懸液。計數，T75培養瓶中加入25 mL培養液及6 000 IU／mL IL－2培養。2 d后，用抗CD3抗體磁珠（Dynal Biotech，Lake Success，NY，USA）法純化，敲除T細胞，制成NK細胞，再加入6 000 IU／mL IL－2培養2～3 d后，制得活化的NK細胞。收獲細胞，把每管0.5×107／mL細胞離心，取沉淀，混勻，添加抗體NK 1.1＋、NKp 46、CD3＋、CD4＋和CD8＋各2μL，流式細胞儀（fluorescence activated cell sorter，FACS）檢測表型。NK細胞表型：NKp46＞90%，NK1.1＋＞90%，CD8＋＜2%，CD4＋＜2%。同上提取脾細胞，加入8μg／mL PHA和600 IU／mL IL－2培養。2 d后，可見大量細胞聚集成團，靜置5～7 min，輕輕拋棄上清液，即可獲得細胞團塊，再加入600 IU／mL IL－2培養2 d后，即可制得CTL細胞。CTL細胞表型：CD8＋＞90%，CD3＋＞90%，NK1.1＋＜5%，CD4＋＜2%。NK細胞在IL－2，IL－2＋IL－12，IL－2＋IL－18或IL－2＋IL－12＋IL－18條件下培養，提取上清液。同上法準備NK細胞，用抗CD3磁珠法純化，再加入6 000 IU／mL IL－2培養1 d后，加入IL－12（10 ng／mL）和IL－18（100 ng／mL）或同時加入IL－12（10 ng／mL）及IL－18（100 ng／mL），再培養48 h后，2 000 r／min離心10 min，收集上清液，－80℃凍存備用。

1.3 ELISA法檢測上清液的IFNγ含量 將各種細胞因子活化的NK細胞上清液分為4組，分別為NK上清液，NK＋IL－12上清液，NK＋IL－18上清液，NK＋IL－12＋IL－18上清液，按照說明書應用雙抗體夾心ELISA法檢測IFNγ，重復3次。

1.4 檢測M05細胞表面MHCⅠ（H－2Kb）表達 收集M05細胞，調整細胞密度為1×107／mL，與NK細胞在IL－2，IL－2＋IL－12，IL－2＋IL－18，IL－2＋IL－12＋IL－18條件下提取的上清液125μL孵育過夜。1 d后，收獲所有腫瘤細胞，加入H－2Kb抗體染色30 min，PBS緩沖液洗滌2次后，0.25%多聚甲醛固定，FACS計數5 000細胞，檢查MHCⅠ表達。

1.5 檢測NK細胞對CTL細胞的殺傷率 將51Cr溶液與靶細胞[與不同NK上清液及干擾素γ（IFNγ）]10 ng／mL培養過夜M05細胞，高表達MHCⅠ類分子；或預先用6μg／mL IFNγ抗體與1∶8 NK細胞上清液及IFNγ10 ng／mL各1 mL孵育30 min后，再與NK上清液培養過夜的M05細胞）混合，實驗共分為6組，分別為M05組（陰性對照組），M05＋IFNγ組（陽性對照組），M05＋NK上清液組，M05＋NK＋IL－12上清液組，M05＋NK＋IL－18上清液組，M05＋NK＋IL－12＋IL－18上清液組，于37℃培養1 h左右，洗去游離的51Cr后，即可得到51Cr標記的靶細胞。收集CTL細胞，將待檢細胞毒性的細胞與51Cr標記的靶細胞混合4 h（比例約為200∶1），用γ射線測量儀檢測上清液中的51Cr放射脈沖數（cpm）值，即可計算出待檢細胞殺傷活性的高低。

特異性腫瘤細胞殺傷率（%）＝（特異性釋放－自發性釋放）／（最大量釋放－自發性釋放）×100%

1.6 統計學處理 應用SPSS 10.0軟件進行統計學處理，計量資料以±s表示，IFNγ抗體封閉后采用配對設計t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NK細胞上清液對M05細胞表面MHCⅠ表達的結果 IL－2能夠激活NK細胞增殖，結合其他細胞因子如IL－12及IL－18，能大量刺激NK細胞增殖，釋放大量細胞因子，從IL－2、IL－2＋IL－12、IL－2＋IL－18、IL－2＋IL－12＋IL－18條件下活化的NK細胞提取的上清液，即使稀釋濃度為1∶8，也能有效提高M05細胞表面MHCⅠ表達。加入6μg／mL IFNγ抗體與NK上清液125μL孵育30 min，再與腫瘤細胞孵育過夜后，升高的MHCⅠ降至正常。見表1。

表1 M05細胞與1∶8 NK上清液＋／－IFNγ抗體MHC平均熒光強度的表達

2.2 IL－2、IL－2＋IL－12、IL－2＋IL－18、IL－2＋IL－12＋IL－18活化NK細胞分泌的IFNγ含量 NK＋IL－12上清液、NK＋IL－18上清液、NK＋IL－12＋IL－18上清液的IFNγ高于NK上清液的IFNγ含量（P＜0.05）。見表2。

表2 NK上清液、NK＋IL－12上清液、NK＋IL－18上清液、NK＋IL－12＋IL－18上清液的IFNγ含量

2.3 CTL細胞對黑色素瘤靶細胞的殺傷活性 M05黑色素瘤細胞高表達OVA抗原及低表達MHCⅠ類分子，與NK上清液孵育過夜后能提高M05細胞表面MHCⅠ類分子的表達，CTL細胞對靶細胞的殺傷活性明顯增強（P＜0.05），見圖1。

2.4 CTL細胞對腫瘤細胞4 h的殺傷率 1∶8 NK細胞上清液與CTL細胞孵育過夜后，可見與NK細胞上清液孵育的CTL細胞并不能提高CTL細胞對M05細胞殺傷率，見圖2。

圖1 CTL對靶細胞4 h細胞毒性（n＝3）

圖2 CTL細胞對腫瘤細胞4 h的殺傷率（n＝3）

3 討 論

本研究證實，體內外活化NK細胞需要IL－2維持，其他細胞因子，如IL－12及IL－18能增強其作用，IL－2是激發細胞因子如TNFα及IFNγ級聯反應的關鍵因素。作者資料顯示IL－2、IL－2＋IL－12、IL－2＋IL－18、IL－2＋IL－12＋IL－18條 件下培養NK細胞在形態及功能上具有明顯差異，并且IL－2＋IL－12、IL－2＋IL－18、IL－2＋IL－12＋IL－18培養NK細胞分泌的IFNγ比僅用IL－2培養NK細胞更高，并 且，IL－12，IL－18需 要 與IL－2共同刺激才能使NK細胞活化并分泌大量IFNγ[12]。研究證實，不同細胞因子刺激的NK細胞上清液均能提高M05細胞MHCⅠ類分子的表達，并且只需要1∶8上清液即可顯著提高M05細胞MHCⅠ表達，其作用機理與NK細胞上清液中的IFNγ含量有關，抑制IFN的表達即可降低腫瘤細胞表面MHCⅠ分子。

CTL細胞在體內能直接破壞黑色素瘤細胞，因此，CTL細胞已經成為腫瘤免疫的熱點之一[13]。本研究結果顯示，正常M05細胞低表達MHCⅠ類分子而高表達OVA抗原，因此，CTL細胞對其殺傷率低，但M05細胞與NK上清液培養后，提高黑色素瘤細胞表面MHCⅠ類分子的表達，從而提高CTL細胞對黑色素瘤細胞的殺傷性，這種殺傷作用通過提高黑色素瘤細胞表面MHCⅠ類分子的表達而發揮間接作用，為進一步研究聯合應用NK及CTL細胞協調殺傷腫瘤細胞提供良好的理論基礎。

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