RP-HPLC測(cè)定健脾益腎顆粒中齊墩果酸的含量

李 勝 涂文升 鄧秋麗

（廣西腫瘤防治研究所藥劑科，廣西 南寧 530021）

健脾益腎顆粒由黨參、枸杞子、女貞子、白術(shù)、菟絲子、補(bǔ)骨脂（鹽灸）等中藥經(jīng)提取加工而成的顆粒劑。具有健脾益腎的功效，用于減輕腫瘤病人術(shù)后放、化療副反應(yīng)，提高機(jī)體免疫功能以及脾腎虛弱所引起的疾病。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1]：健脾益腎顆粒能有效地減輕腫瘤患者化療的毒副作用，提高患者的免疫功能；臨床研究表明健脾益腎顆粒能預(yù)防化療后白細(xì)胞減少[2]；對(duì)腫瘤患者化療中或化療后的脾腎兩虛癥具有明顯的療效[3]。對(duì)肺癌化療相關(guān)性貧血有一定治療作用[4]。健脾益腎顆粒可改善脾腎陽虛型慢性腎炎患者的臨床癥狀、體征及炎癥介質(zhì)鳥IL-6的水平，療效優(yōu)于腎炎四味片[5]。對(duì)慢性乙型病毒性肝炎患者的治療顯示其具有免疫細(xì)胞增生作用，肝功能恢復(fù)良好，具有較強(qiáng)護(hù)肝、抗炎作用，是臨床療效較好的護(hù)肝藥，同時(shí)具有促進(jìn)慢性乙型病毒性肝炎患者免疫功能的作用[6]。未檢索到有測(cè)定健脾益腎顆粒含量的文獻(xiàn)報(bào)道。在參考有關(guān)文獻(xiàn)[7]的基礎(chǔ)上，建立了反相高效液相色譜法測(cè)定健脾益腎顆粒中齊墩果酸含量的方法，本法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，可作為健脾益腎顆粒的質(zhì)量控制指標(biāo)。

1 儀器與試劑

島津LC-10AVP高效液相色譜儀、SPD-10AVP紫外外-可見檢測(cè)器、WML-2010（色譜工作站）；甲醇（高效液相色譜淋洗劑，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、磷酸為分析純，雙蒸水（自制）。

齊墩果酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0709-9808）；健脾益腎顆粒為北京XX制藥廠產(chǎn)品（批號(hào)：10010103、10010306、10010320）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Platisil ODS柱（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇-水-冰醋酸（30∶63∶3），流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，柱溫40℃。結(jié)果見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸對(duì)照品10.5mg，置50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液（0.21mg/L）。

2.3 供試品溶液的制備

取健脾益腎顆粒適量，研磨，精密取健脾益腎顆粒粉末2.00g，置具塞三角燒瓶中，加入流動(dòng)相20.0mL，搖勻，稱重，超聲提取40min，取出，放至室溫，再稱定重量，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾紙過濾，取續(xù)濾液1.0mL，離心15min（15 000r/min），上清液即為供試品溶液。

2.4 空白試驗(yàn)

取除去女貞子以外的其他4味藥材，按樣品制備方法制成陰性溶液。精密吸取供試品溶液、陰性溶液各15.0μL，對(duì)照品溶液10.0μL，注入液相色譜儀中，繪制液相色譜圖，由色譜圖看出，在對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性溶液在此峰位無吸收，對(duì)本品中齊墩果酸的含量測(cè)定無干擾，方法專屬性良好。見圖1。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線考察

精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5μL，分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程Y=4.8×105+7.5×103X，r=0.999 9，結(jié)果表明，齊墩果酸在0.525～3.675μg的線性范圍線性關(guān)系良好，測(cè)得最低檢出限為0.525μg。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果齊墩果酸峰面積RSD為1.67%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

2. 樣品HPLC色譜圖

3.齊墩果酸線性關(guān)系圖

4. 缺柚皮苷的HPLC色譜圖

取供試品溶液室溫放置，分別于制備后0、4、8、12、24、48h 進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果齊墩果酸峰面積RSD為1.15%。表明齊墩果酸在48 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取同一樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下操作，制成供使品溶液，進(jìn)行測(cè)定，齊墩果酸含量RSD為1.70%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密取2.0已知含量的健脾益腎顆粒粉末，加入適量的標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)液，按2.3方法制成供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.10 樣品含量測(cè)定

分別精密取不同批號(hào)的健脾益腎顆粒粉末共9份（每一批號(hào)3份），按“2.3”項(xiàng)下制備，各取15.0μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。含量測(cè)定結(jié)果見表2。

3 討 論

健脾益腎顆粒是以中藥經(jīng)科學(xué)組方，現(xiàn)代工藝制備的顆粒型制劑。具有保肝、護(hù)肝、提高患者抵抗力及減輕惡性腫瘤患者因放、化療引起的毒副作用等[1-7]。但利用多種搜索引擎及維普數(shù)據(jù)庫(kù)均沒有發(fā)現(xiàn)該制劑的質(zhì)量控制方法。本文在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立簡(jiǎn)便、快速、可靠的用RP-HPLC法測(cè)定該制劑中齊墩果酸的含量作為其質(zhì)量控制指標(biāo)。

該方法取健脾益腎顆粒，研磨，精密稱取2.0g，置于具塞三角燒瓶中，加入20.0mL流動(dòng)相，密塞，稱重，置于CQ-80超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠），超聲提取40min，放至室溫，稱重，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾紙過濾，取續(xù)濾液1.0mL，離心15min（15 000r/min），上清液即可進(jìn)樣測(cè)定，齊墩果酸的理論塔板數(shù)均在1 1000以上，分離度均＞1.5。完全達(dá)到藥典的一般藥物分析的要求。

經(jīng)上述HPLC條件及方法的測(cè)定，健脾益腎顆粒每克含齊墩果酸在40.4087～42.4021mg范圍之間，按藥典規(guī)定每克健脾益腎顆粒含齊墩果酸應(yīng)不低于38.3883mg。

筆者曾用健脾益腎顆粒，分別加入甲醇、甲醇-水超聲提取30min；還用加熱回流3h，經(jīng)測(cè)定無齊墩果酸保留峰。還用甲醇-水溶解，三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷提取液，水浴揮干，用5mL甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5mL的量瓶中，取1.0mL，離心10min（15000r/min），注入高效液相色譜儀中測(cè)定，分離效果也較好，但經(jīng)過對(duì)比，齊墩果酸的含量較少，即提取不完全，沒有本法的效果好。

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