PPARγ激動劑對急性壞死性胰腺炎大鼠p38MAPK活化的影響

李清華 徐萍 王靜 姜景平 陳令全

PPARγ激動劑對急性壞死性胰腺炎大鼠p38MAPK活化的影響

李清華 徐萍 王靜 姜景平 陳令全

p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)在炎癥反應中通過調節炎癥因子表達起重要作用[1]。我們前期研究發現，過氧化酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorsγ，PPARγ)激動劑吡格列酮對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠血清促炎細胞因子有抑制作用。本研究探討p38 MAPK在ANP發生、發展中的作用及吡格列酮對p38 MAPK的影響，進一步了解PPARγ激動劑的抗炎機制。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：54只雄性SD大鼠，清潔級，體重160～200 g，購自南昌大學醫學院動物實驗中心。按數字表法隨機分成對照組、ANP組及吡格列酮干預組(干預組)，每組18只。采用胰管逆行注射50 g/L?；悄懰徕c(Sigma公司)1 μl/g體重的方法制備ANP模型。對照組開腹后只翻動胰腺并以鈍器輕劃胰腺3次后關腹。干預組在術后立即腹腔內注射10% DMSO-吡格列酮溶液50 mg/kg體重。術后3、6、12 h分批經腹主動脈放血處死大鼠, 觀察胰腺大體病理改變，并取胰頭部組織，部分用40 g/L中性甲醛固定，部分置液氮保存。

2．胰腺病理檢查：胰腺大體病理觀察采用Hughes等[2]標準，從水腫、出血、脂肪壞死3個方面進行評分。福爾馬林固定標本常規石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下每張切片隨機選擇5個高倍視野觀察胰腺組織病理學變化，并依據Schmidt等[3]標準從水腫、感染、出血和壞死4個方面評分。

3．磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)檢測：取凍存標本100 mg，常規提取總蛋白，BCA蛋白濃度分析試劑盒測定蛋白濃度，應用蛋白質印跡法檢測p-p38MAPK。p-p38MAPK單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgM購自Santa cruz公司。用Bandscan圖像分析系統掃描目的條帶積分灰度值表示其相對表達量。

4．生存率實驗：16只雄性SD大鼠隨機分成ANP組和干預組，造模方法同上。干預組大鼠術后每12 h重復給予吡格列酮 50 mg/kg體重，ANP組給予10% DMSO，觀察兩組大鼠制模后60 h的生存率。

二、結果

1．胰腺病理改變：對照組大鼠胰腺眼觀呈淡粉紅色，薄片狀，顏色均勻一致，光澤度好；ANP組在注射后沿胰膽管周圍組織立即充血、水腫，并逐漸擴展；干預組大鼠大體改變與ANP組相似，但病變程度較同時點ANP組輕。胰腺大體病理評分見表1。干預組6、12 h時的胰腺損傷較同時點ANP組顯著減輕(P值為0.02483、0.04126)。鏡下見對照組胰腺無明顯病理改變；ANP組胰腺明顯水腫，小葉間隔增大，間質內充斥大量淡紅色水腫液，部分腺泡呈孤島狀，并可見大片出血壞死，腺泡小葉結構被破壞，松散、紊亂，胰腺實質及間質內見大量嗜中性粒細胞及單核細胞等炎癥細胞浸潤；干預組鏡下表現與ANP組大體相似，但病變程度較輕(圖1)。胰腺病理組織學評分見表1。ANP組和干預組的胰腺病理評分均顯著高于對照組；但干預組12、24 h時的病理評分較同時點ANP組顯著降低(P=0.00328)。

表1 3組大鼠胰腺大體及組織學評分

注：與對照組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

圖1對照組(a)、ANP組(b)、干預組(c)大鼠6 h時的胰腺病理組織學變化(×200)

2．胰腺組織p-p38MAPK水平：對照組胰腺低表達p-p38MAPK；ANP組p-p38MAPK表達在造模后3 h即上升到峰值，12 h時的表達水平明顯下降，但仍然顯著高于對照組(P=0.02386)；干預組p-p38MAPK表達均顯著高于對照組，但6 h時的表達顯著低于ANP組(P=0.04126，表2，圖2)。

表2 3組大鼠胰腺組織p-p38MAPK的表達

注：與對照組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

圖2 對照組、ANP組、干預組大鼠胰腺組織p-p38MAPK的表達

3．大鼠生存率：ANP組大鼠造模后12 h死亡3只，24、36、48 h各死亡1只，60 h的生存率為12.5%；干預組造模后24 h死亡1只，36、48 h各死亡2只，60 h生存率為37.5%，兩組差異無統計學意義(P=0.248)。

討論各種炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)和損傷刺激都可造成p38MAPK信號系統的激活，從而調控下游基因包括TNF-α、IL-6等的表達，并促進中性粒細胞的呼吸爆發[4]。p38MAPK信號轉導通路參與維持細胞的基礎生理狀態，因此，正常胰腺腺泡細胞有其低表達[5]。Blinman等[6]研究顯示，p38MAPK在調節胰腺腺泡細胞的細胞因子和趨化因子產生的信號通路中占主導地位，在重癥急性胰腺炎發病早期及疾病進展中起重要推動作用。Ren等[7]報道，牛磺膽酸鈉誘導的ANP大鼠在造模后3 h p38MAPK活性迅速達到峰值，24 h時仍明顯高于基礎活性。本結果顯示，造模后3 h，磷酸化的p38MAPK表達即達到峰值，并維持在較高水平，12 h時仍高于對照組水平，提示在ANP發病早期p38MAPK即參與炎癥反應。與Ren等的研究結果一致。

p38MAPK和NF-κB是調節胰腺腺泡細胞產生細胞因子和趨化因子的兩條重要信號通路。Jiang等[8]及Ricote等[9]報道，PPARγ激動劑能通過抑制NF-κB而調節炎癥反應。我們的前期研究也證實了PPARγ激動劑吡格咧酮可通過抑制NF-κB活化及抑制促炎細胞因子的表達而減輕胰腺炎癥[10]。本結果顯示，給予吡格咧酮可明顯抑制p38MAPK的活化，減輕ANP大鼠的胰腺病理損傷，明顯提高ANP大鼠生存率，提示PPARγ激動劑干預處理可能是早期控制SAP病情的有效手段。

[1] Dong C, Davis RJ, Flavell RA. MAP kinases in the immune response. Annu Rev Immunol, 2002, 20:55-72.

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[8] Jiang C, Ting AT, Seed B. PPAR-gamma agonists inhibit production of monocyte inflammatory cytokines. Nature, 1998,391:82-86.

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[10] Xu P, Zhou XJ, Chen LQ, et al. Pioglitazone attenuates the severity of sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol, 2007,13:1983-1988.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.022

201600 上海，上海交通大學附屬第一人民醫院松江分院消化內科

徐萍，Email:yfyxp@yahoo.com.cn

2011-10-12)

(本文編輯：屠振興)