重癥急性胰腺炎患者治療前后血清蛋白組學的變化

任俊 余開煥 馬鵬 余佳 陳辰 張愛民

·論著·

重癥急性胰腺炎患者治療前后血清蛋白組學的變化

任俊 余開煥 馬鵬 余佳 陳辰 張愛民

目的比較重癥急性胰腺炎(SAP)患者治療前后血清蛋白質組表達差異，尋找能夠判斷SAP病情好轉的血清蛋白質。方法利用表面增強激光解析離子化飛行時間質譜(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)分析20例SAP患者治療前及治療后7 d的血清蛋白質譜，并進行APACHEⅡ評分。結果SAP患者治療后7 d的APACHEⅡ評分為(10.70±3.47)分，顯著低于入院時的(13.00±2.21)分(t=4.272,P=0.002)。治療前后一共檢測到血清中132個蛋白質峰，其中質荷比2000至40 000間有27個差異蛋白質峰(P<0.05)。分子質量47 000的蛋白在SAP病情緩解后表達下調，分子質量115 000及159 000的蛋白在SAP治療后明顯上調。結論用SELDI-TOF-MS技術能檢出SAP患者治療前后血清蛋白質的差異表達，分子質量115 000和159 000蛋白的上調及47 000蛋白的下調可能是SAP病情好轉的征兆。

胰腺炎，急性壞死性； 蛋白質組； 血清； 預測和判斷

目前臨床上有多種預測急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)嚴重程度的方法[1-2],其中以APACHE Ⅱ評分最為常用，也得到了廣泛的認可，但其評分項目繁多，計算方法復雜，臨床使用價值有限[3]。因此需要尋找能夠判斷AP嚴重程度和預后的簡單而實用的特異性標志物。本研究檢測重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)患者在治療前后血清蛋白質譜表達的差異，以篩選反映SAP治療效果和預后的蛋白質。

材料和方法

一、臨床資料

選取2010年7月至12月武漢大學人民醫院肝膽外科收治的臨床資料完整的20例SAP患者為研究對象，其中男性11例，女性9例，平均年齡(45±18)歲。發病至入院平均時間為(7±4)h，且未做任何治療。所有患者診斷均符合2007年《重癥急性胰腺炎診治指南》的標準[4]。入院后均行常規個體化綜合非手術治療。入院第1天及治療后7 d進行APACHEⅡ評分。

二、血清蛋白組學檢測

治療前及治療后7 d各抽取外周靜脈血2 ml，3000 r/min離心10 min，取血清，置-80℃保存。

檢測前4℃下融解血清，每10 μl血清中加入20 μl U9裂解液(9 mol/L urea，2% CHAPS，50 mmol/L Tris-HCL，1% DDT,pH9.0)孵育30 min，加入370 μl WCX緩沖液(50 mmol/L NaAc，pH4.5)稀釋。每個PCR管中加入50 g/L WCX磁珠100 μl，置磁性分離板上分離2 min，棄去上清液，加入100 mmol/L NaAc 100 μl活化2次。活化的納米磁珠中加入100 μl處理好的血清樣品，震蕩孵育1 h，置磁性分離板上分離2 min，棄上清液，加入100 mmol/L NaAc 100 μl洗滌2次，用10 μl 1% TFA洗脫結合在磁珠上的蛋白，取5 μl蛋白洗脫液加5 μl SPA飽和液(50% ACN+0.5% TFA)充分混合，取2 μl混合液點樣于僅起載體作用的金芯片上(Au-chip.Biorad),自然風干，采用SELDI-TOF-MS(BIORAD)采集蛋白表達譜。

儀器主要參數：激光強度175，檢測靈敏度6，優化分子質量范圍1000～20 000，最高分子質量為50 000。收集樣品點數100次。數據收集分子質量范圍1000～50 000。先用信噪比(s/n)>5和>2各過濾一次。篩出的質荷比峰在10%以上的樣本中同時存在，且同一質荷比峰在不同樣本中的偏差<0.3%(以去除原始數據中的噪聲)。經上述處理后，用Ciphergen proteinchip3.1軟件自動采集數據，根據所獲得的原始數據快速精確地繪制出蛋白質譜圖，其中縱坐標為波峰強度，即蛋白質相對含量，橫坐標為質荷比(M/Z)，即蛋白質相對分子質量。

三、統計學處理

結 果

一、APACHEⅡ評分的變化

SAP患者入院第1天的APACHEⅡ評分為(13.00±2.21)分，治療后7 d的APACHEⅡ評分為(10.70±3.47)分，兩者差異具有統計學意義(t=4.272，P=0.002)，表明SAP病情緩解。

二、差異表達蛋白的篩選

SAP患者治療前后血清中一共檢測到132個蛋白質峰，質荷比在2000～40 000間有27個差異表達蛋白質(P<0.05)，其中分子質量47 000的蛋白在SAP病情緩解后表達下調，分子質量115 000及159 000的蛋白在SAP治療后明顯上調(圖1)。

圖1治療前(1)后(2)分子質量47 000(a)、115 000(b)、159 000(c)蛋白的質譜圖

討 論

SAP患者約占AP的15%～20%，常出現危及生命的全身并發癥或局部并發癥，病死率可達15%～56%[5]。AP時胰腺最早的改變是局部的炎癥伴隨著消化酶顆粒的激活，繼而表現全身炎癥反應，最終導致多器官損傷。胰腺內外及細胞內外的各種因素均參與AP的病理生理改變，在局部和全身的炎癥反應中起著重要作用[6]。Fétaud1等[7]證實，AP時的炎癥可增加血管通透性，使胰腺局部蛋白及炎癥介質進入血液，導致AP血清蛋白質也發生相應的改變。我們前期實驗應用SELDI-TOF-MS技術檢測SAP和輕癥急性胰腺炎(MAP)大鼠血清蛋白質組學，發現分子質量在9500和9700的蛋白表達下降是MAP向SAP轉化的征兆[8]。Papachristou等[9]也發現SAP患者血清分子質量43 000和117 000的兩個蛋白明顯不同于MAP患者，其中分子質量117 000蛋白區分MAP和SAP的敏感性接近100%，特異性達81%。本研究應用SELDI-TOF-MS技術檢測SAP患者治療前后的血清蛋白質譜的變化，發現27個差異表達蛋白質，其中分子質量47 000、115 000及159 000蛋白的差異最為明顯，47 000蛋白在SAP病情緩解時表達減少，而115 000及159 000蛋白則表達增加。提示分子質量47 000蛋白表達下調、115 000和159 000蛋白表達上調可能是SAP患者治療后病情緩解的預兆，為臨床評估SAP的嚴重程度及治療效果提供新的指標。

[1] Ranson JH, Rifkind KM, Roses DF, et al. Prognostic signs and the role of oprative management in acute pancreatitis. Surg Gynecol Obstet, 1974, 139:69-81.

[2] Balthazar EJ, Robinson DL, Megibow AJ, et al. Acute pancreatitis:value of CT in establishing prognosis.Radiology,1990,174:331-336.

[3] 李新, 鐘碧慧, 晁康, 等. 急性胰腺炎嚴重程度預測方法新進展.中華胰腺病雜志, 2011,11:375-377.

[4] 中華醫學會外科學分會胰腺外科學組.重癥急性胰腺炎診治指南.中華外科雜志, 2007, 45:727-729.

[5] Casas JD, Díaz R, Valderas G, et al. Prognostic value of CT in early assessment of patients with acute pancreatitis. AJR, 2004, 182:569-574.

[6] Pandol SJ, Saluja AK, Imrie CW, et al. Acute pancreatitis: bench to the bedside. Gastroenterology, 2007, 132:1127-1151.

[7] Fétaudl V, Frossard JL, Farina A, et al. Proteomic profiling in an animal model of acute pancreatitis. Protemics, 2008, 8:3621-3631.

[8] 余開煥, 任俊, 黃運濤, 等. 急性胰腺炎大鼠血清蛋白質組學分析.中華胰腺病雜志, 2011,11:329-331.

[9] Papachristou GI, Malehorn DE, Lamb J, et al. Serum proteomic patterns as predictor of severity in acute pancreatitis. Pancreatology, 2007,7:317-324.

Serumproteomicanalysisofpatientwithsevereacutepancreatitisbeforeandaftertreatment

RENJun,YUKai-huan,MAPeng,YUJia,CHENChen,ZHANGAi-min.

DepartmentofHepatobiliary&LaparoscopicSurgery,People′sHospital,WuhanUniversity,Wuhan430060,China

YUKai-huan,Email:yukaihuan@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate the different expression of the serum proteome of patient with severe acute pancreatitis (SAP) before and after treatment, and search for the protein that can predict SAP improvement.MethodsSELDI-TOF-MS was used to analyze the expression of serum protein spectrum of 20 SAP patients before treatment and 7 days after treatment, and make the APACHEⅡ score at the same time.ResultsThe APACHEⅡ score was 10.70±3.47 in patients with SAP 7 days after treatment, which were significantly lower than that before treatment (13.00±2.21,P<0.05). One hundred thirty-two spectral peak clusters were detected before and after treatment, there were 27 proteins that had significantly different signal intensities had been detected from 2000 Da to 50000 Da (P<0.05). The peak cluster at 47 000 Da was significantly down-regulated after SAP attenuation. While the peak clusters at 11 700 Da and 15 900 Da were significantly up-regulated after treatment.ConclusionsSerum analysis with SELDI-TOF MS can detect the different expression of the SAP serum proteomics before and after treatment, the increased expression of the protein with molecular weight of 11 500 Da and 15 900 Da and the decreased expression of 4700 Da may be a signal of improvement of SAP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Proteome; Serum; Forecasting

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.001

湖北省自然科學基金(131349)

430060 武漢，武漢大學人民醫院肝膽腔鏡外科

余開煥，Email:yukaihuan@medmail.com.cn

2011-11-22)

(本文編輯：呂芳萍)