TLR4 shRNA質粒的構建及穩定轉染人胰腺癌PANC1細胞株的篩選

張建軍 王博 田元 張景輝 吳河水

·論著·

TLR4 shRNA質粒的構建及穩定轉染人胰腺癌PANC1細胞株的篩選

張建軍 王博 田元 張景輝 吳河水

目的構建靶向人TLR4基因的短發夾RNA(shRNA)真核表達質粒，轉染胰腺癌細胞，并篩選出穩定轉染的克隆細胞株。方法采用小分子干擾RNA(siRNA)軟件設計3個靶向TLR4基因的shRNA，構建3個質粒表達載體，分別命名為TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3；選取抑制效率最高的shRNA質粒，采用脂質體法轉染胰腺癌PANC1細胞；實時定量PCR和流式細胞技術檢測細胞TLR4 shRNA基因沉默效率和轉染效率；G418抗性篩選和有限稀釋單克隆形成法挑選培育穩定轉染TLR4 shRNA的單克隆細胞系。結果轉染48 h后PANC1細胞瞬時轉染效率為(46.72±5.06)%。轉染TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3的細胞的TLR4 mRNA表達水平分別為0.025±0.004、0.027±0.003、0.019±0.006，均顯著低于未轉染組的0.061±0.018和陰性對照轉染組的0.057±0.015(P值均<0.05)。以沉默效果最佳的TLR4-3轉染細胞所獲得的穩轉細胞的轉染效率為(82.79±8.16)%，較瞬轉細胞顯著提高(P=0.001)；TLR4 mRNA表達水平為0.010±0.002,較瞬轉細胞顯著下調(P=0.001)；TLR4蛋白表達率為(0.54±0.32)%，顯著低于未轉染細胞的(87.42±5.00)%和轉染陰性對照細胞的(82.90±5.00)%(P=0.000)。結論成功篩選到TLR4基因沉默的穩轉PANC1細胞。

胰腺腫瘤； Toll樣受體4； 轉染； RNA干擾

Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)主要表達于上皮細胞和免疫細胞，在宿主防御反應中起著重要作用[1]。近年來發現，TLR4在很多腫瘤細胞和腫瘤組織中表達上調[2]。我們曾報道TLR4在胰腺癌中高表達，且與腫瘤大小、淋巴結轉移、血管侵犯及臨床分期相關[3]。因此，TLR4可能成為治療胰腺癌的新靶點。本研究應用RNA干擾(RNAi)技術構建靶向TLR4的質粒，轉染人胰腺癌PANC1細胞，篩選穩轉細胞克隆。

材料和方法

一、靶向TLR4表達質粒的構建

用siRNA WizardTMInvivogen軟件設計3個靶向人TLR4基因cDNA序列的短發夾RNA(shRNA)，并應用在線軟件BLAST檢索數據庫排除其他基因的同源性序列，其順序為 BamH酶切位點、19 nt正義序列、9 nt loop接頭序列、19 nt反義序列、 12 nt RNA聚合酶終止子(6個T)、Hind酶切位點，分別命名為TLR4-1、TLR4-2和TLR4-3(表1)。攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的TLR4 shRNA 表達質粒由上海吉凱基因公司構建，并經測序證實。陰性對照質粒為該公司提供的攜帶 GFP的空質粒載體。

表1 TLR4 shRNA構建框架序列

二、TLR4 shRNA表達質粒轉染細胞

胰腺癌細胞系PANC1由協和醫院普外科實驗室提供,常規培養傳代。取對數生長期細胞， 以2×105個/孔接種至6孔板中培養24 h，應用LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)將質粒轉染細胞，按試劑盒說明書操作。在熒光顯微鏡下觀測轉染細胞GFP表達，并收集細胞上流式細胞儀檢測GFP表達，計算轉染效率。

三、實時定量PCR檢測TLR4 mRNA的表達

用Trizol提取轉染后細胞總RNA，隨機引物法逆轉錄合成cDNA。應用熒光實時定量PCR盒(Promega公司)檢測TLR4 mRNA表達。 TLR4引物上游5′-ACCTGTCCCTGAACCCTATGAA-3′，下游5′-CTTCTAAACCAGCCAGACCTTG-3′ ，產物138 bp；內參β-actin引物上游5′-AAGGCCAGGTAATTGTCACG-3′，下游5′-AGCAGCTCTGCAGTACGTC-3′，產物105 bp。PCR反應程序：94℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，共45個循環。 PCR結果采用2-△△Ct分析法[4]計算。

四、流式細胞儀檢測TLR4蛋白表達

胰酶消化轉染細胞，PBS洗滌后調整細胞濃度為106個/ml。取200 μl細胞懸液，加入藻紅蛋白(phycoerythrin)標記的TLR4抗體(eBioscience公司)5 μl，4℃避光孵育30 min，上流式細胞儀檢測。

五、穩定轉染TLR4 shRNA的細胞克隆篩選

選取沉默效率最佳的RNAi質粒轉染細胞，按1∶10比例傳代于6孔板，細胞貼壁后用含G418(400～1000 mg/L)的培養基培養2周，挑取單個細胞集落，運用有限稀釋單克隆形成法稀釋后，按每孔1個細胞接種于96孔板，繼續采用800 mg/L G418篩選。1個月后觀察單克隆形成情況，挑選綠色熒光強度最高的克隆進行擴大培養。

六、統計學分析

結 果

一、細胞瞬時轉染效率及TLR4 mRNA表達

重組質粒轉染PANC1細胞48 h后,熒光顯微鏡下見細胞形態無明顯改變，但表達GFP(圖1a)，瞬轉效率為(46.72±5.06)%(圖1b、c)。

轉染TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3的細胞的TLR4mRNA表達水平分別為0.025±0.004、0.027±0.003、0.019±0.006，均顯著低于未轉染組的0.061±0.018和陰性對照轉染組的0.057±0.015(P值均<0.05)。3個轉染組間比較差異無統計學意義，但以TLR4-3的沉默效果最佳。

圖1轉染48 h的PANC1細胞(a，熒光顯微鏡 ×100)及未轉染細胞(b)和轉染細胞(c)的熒光表達細胞比例(流式細胞儀)

二、 穩轉細胞的GFP表達及TLR4 mRNA表達

穩轉細胞廣泛表達GFP(圖2a)，GFP表達率(轉染效率)為(82.79±8.16)%(圖2b、c)，顯著高于瞬轉細胞的(46.72±5.06)%(P=0.001)。穩轉細胞的TLR4 mRNA表達水平為0.010±0.002，顯著低于瞬轉細胞的0.019±0.006(P=0.001)。

圖2穩轉細胞的GFP表達(a，熒光顯微鏡 ×100)及未轉染細胞(b)和穩轉細胞(c)的熒光表達細胞比例(流式細胞儀)

三、穩轉細胞的TLR4蛋白表達

穩轉細胞TLR4蛋白表達率為(0.54±0.32)%，顯著低于未轉染組的(87.42±5.00)%(P=0.000)及陰性對照轉染組的(82.9±5.00)%(P=0.000, 圖3)。

圖3未轉染細胞(a)及穩轉細胞(b)的TLR4蛋白表達(流式細胞儀)

討 論

RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以應用體外轉錄或化學合成siRNA,經脂質體或病毒載體轉染細胞，或應用shRNA表達載體轉染細胞后特異地沉默特定基因。化學合成siRNA抑制作用時間短,成本昂貴,并且易于污染 RNA酶；而shRNA轉染細胞后可以在RNA酶的作用下被切割成與體外合成siRNA相同的序列與結構。因細胞可穩定持續地表達shRNA,從而使RNAi作用持續時間更長、更穩[5]。

近年研究發現，TLR4在很多腫瘤細胞系和腫瘤組織中表達上調[6-7]。我們以往的研究也顯示TLR4在胰腺癌組織中高表達[3]。因此本研究設計合成了3個靶向TLR4的shRNA，將其插入U6 RNA聚合酶 Ⅲ啟動子、卡那耐藥基因、GFP基因的真核表達質粒，具有利用相對單一的啟動子和終止序列產生大量的小RNA，利于穩定傳代細胞株的篩選及在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞儀檢測等優勢。本研究結果顯示，3個shRNA表達質粒轉染細胞后均獲得滿意瞬間轉染效率及基因沉默效應，選擇轉染率最高、基因沉默效應最佳的TLR4-3表達質粒轉染PANC1細胞所獲得的穩轉細胞，其轉染效率顯著高于瞬轉細胞，目的基因的抑制效應亦優于瞬轉細胞，為以 TLR4為靶點的胰腺癌細胞生物學特性研究提供了良好基礎。

[1] Beutler B. Endotoxin, toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity. Curr Opin Microbiol, 2000,3:23-28.

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[3] Zhang JJ, Wu HS, Wang L, et al. Expression and significance of TLR4 and HIF-1 alpha in pancreatic ductal adenocarcinoma. World J Gastroenterol, 2010,16:2881-2888.

[4] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001,25:402-408.

[5] Liu XD, Ma SM, Liu Y, et al. Short hairpin RNA and retroviral vector-mediated silencing of p53 in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun, 2004,324:1173-1178.

[6] Zhou M, McFarland-Mancini MM, Funk HM, et al. Toll-like receptor expression in normal ovary and ovarian tumors. Cancer Immunol Immunother, 2009,58:1375-1385.

[7] Xie W, Wang Y, Huang Y, et al. Toll-like receptor 2 mediates invasion via activating NF-kappaB in MDA-MB-231 breast cancer cells. Biochem Biophys Res Commun, 2009,379:1027-1032.

ConstructionofTLR4shRNAplasmidandscreeningofhumanpancreaticcancerPANC1celllinewithstabletransfection

ZHANGJian-jun,WANGBo,TIANYuan,ZHANGJing-hui,WUHe-shui.

DepartmentofGastrointestinalSurgery,NanshanHospital,GuangdongMedicalCollege,Shenzhen518052,China

WUHe-shui,Email:heshuiwu@163.com

ObjectiveTo construct the eukaryotic plasmid expression vector mediated short hairpin RNA(shRNA) interference targeting TLR4 gene, and transfect it into pancreatic adenocarcinoma cell line PANC1, then screen stably transfected clonal cell line.MethodsThree shRNA interference expression plasmid vectors targeting the TLR4 gene were constructed, named TLR4-1, TLR4-2, TLR4-3.The shRNA plasmid with highest inhibitory efficiency was selected and transfected into PANC1 cells with liposome. The silencing efficiency and transfection efficiency of TLR4-shRNA was assayed with real-time quantitative PCR and flow cytometry analysis. Monoclonal cell with stable transfection of TLR4-shRNA were selected by geneticin 418(G418) and limiting dilution analysis.ResultsTransient transfection efficiency of PANC1 was (46.72±5.06)%. TLR4 mRNA expressions were 0.025±0.004,0.027±0.003,0.019±0.006in cells transfected with TLR4-1, TLR4-2, TLR4-3, respectively, which were significantly lower than that in untransfected group (0.061±0.018) and negative control group (0.057±0.015,P<0.05). The transfection efficiency of TLR4-3 vector in stably transfected clones [(82.79±8.16)%] was significantly higher than that of transient transfection (P=0.001). The expression of TLR4 mRNA was decreased to 0.010±0.002, which was significantly lower than that of transient transfection (P=0.001). The expression of TLR4 protein was (0.54±0.32)%, which was significantly lower than that of untransfected cells [(87.42±5.00)%] and that of negative control [(82.9±5.00)%,P=0.000].ConclusionsStable transfection PANC1 cell lines with TLR4 gene silencing are successfully identified.

Pancreatic neoplasms; Toll like receptor 4; Transfection; RNA interference

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.012

國家自然科學基金(30972898)

518052 深圳，廣東醫學院附屬南山醫院胃腸外科(張建平)；華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院胰腺外科中心(張建軍、王博、田元、張景輝、吳河水)

吳河水，Email：heshuiwu@163.com

2011-11-25)

(本文編輯：呂芳萍)