穩定高表達p75NGFR的胰腺原位荷瘤裸鼠模型的建立

王煒 陳曉東 朱明華 鄭建明 陳穎

穩定高表達p75NGFR的胰腺原位荷瘤裸鼠模型的建立

王煒 陳曉東 朱明華 鄭建明 陳穎

由于目前尚無有效的篩查和早期診斷方法,確診時80%的胰腺癌患者已出現轉移,錯過了手術機會[1-3]，臨床上很難獲得新鮮的、不同時期的組織標本,更不可能在臨床上觀察胰腺癌進展過程[4]。因此,建立理想的胰腺癌動物模型，將為進一步深入研究胰腺癌的生長、侵襲和轉移及其分子生物學特性提供動物實驗平臺。

一、材料和方法

1．材料：雄性裸鼠30只，清潔級，2周齡，體重12～18 g，購自中國科學院上海動物研究所。常規復蘇前期實驗建立的穩定表達p75NGFR的人胰腺癌細胞p75-SW1990[5]，以不轉染的SW1990細胞和只轉染空載體pCDNA3.1的細胞pC-SW1990為對照組。3組細胞分別常規培養，取對數生長期細胞，離心、重懸于37°C的生理鹽水中，調整細胞濃度為4×107個/ml。

2．皮下荷瘤動物模型建立：取裸鼠15只，按數字表法隨機分為3組，每組5只。分別接種p75-SW1990、SW1990、pC-SW1990細胞。具體操作如下：用0.1 ml注射器將上述3種細胞懸液分別接種于裸鼠耳后皮下，每只接種100 μl(4×106個)細胞懸液。次日開始每天觀察動物生長和成瘤情況,用游標卡尺測量腫瘤大小。接種3周后處死裸鼠，取瘤體組織，部分制成冷凍切片確認組織結構，剩余部分剪切成0.1 mm3的組織塊置37℃生理鹽水備用。

3．胰腺原位腫瘤模型建立：另取15只裸鼠，同樣隨機分p75-SW1990組、SW1990組和pC-SW1990組，每組5只。將上述3種0.1 mm3的腫瘤組織塊分別移植到各組裸鼠胰頭部，并用細絲線固定以免組織塊滑脫，關腹后置同樣條件下飼養。次日開始每日觀察動物的一般情況，于移植后第4周處死動物，開腹觀察成瘤情況,游標卡尺測量腫瘤大小。取新鮮瘤體組織，部分置4%多聚甲醛溶液固定，常規病理檢查；部分置液氮保存。

4．瘤組織p75NGFR表達檢測： 用微波勻漿上述液氮冷凍的腫瘤組織,PBS沖洗3次后加入冰冷的100 μl單細胞裂解緩沖液[50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),150 mmol/L NaCl, 0.02%疊氮鈉,100 mg/L PMSF, 1 mg/L Aprotinin, 1% Triton X-100],置冰上孵育20 min，12 000 r/min離心2 min,收集上清,測蛋白濃度。取50 μg蛋白常規行蛋白質印跡法檢測p75NCFR蛋白表達。p75NGFR多克隆抗體工作濃度1∶800；通用型辣根過氧化物酶標記的二抗工作濃度1∶800,最后ECL發光。

二、結果

1．裸鼠胰腺成瘤情況：移植后次日SW1990組裸鼠死亡1只，其余裸鼠于移植后1～2周開始消瘦，但均存活至移植后4周。開腹后見腫瘤位于胰頭部，呈圓形或不規則形(圖1)，部分腫瘤與肝、胃粘連，連同紅褐色肝組織一同取下(圖2)。p75-SW1990、SW1990、pC-SW1990組腫瘤成瘤率分別為60%(3/5)、100%(4/5)、100%(5/5)；瘤體大小分別為(0.30±0.02)、(0.54±0.44)、(0.55±0.07)cm3，p75-SW1990組瘤體明顯小于SW1990和pC-SW1990組(P值均<0.01)；SW1990、pC-SW1990組分別有3、2只有腹水形成。

圖1胰腺原位腫瘤的解剖關系圖23組胰腺原位腫瘤的大小

2．腫瘤組織p75NGFR蛋白的表達：p75-SW1990組腫瘤組織檢測到p75NGFR蛋白的表達,而SW1990、pC-SW1990組腫瘤組織均未檢測到p75NGFR蛋白的表達(圖3)。

圖3 3組腫瘤組織內p75NGFR的表達

討論胰腺癌造模方法主要可分為化學誘導模型、基因工程模型和移植接種模型[6]，其中移植接種法造模具有成瘤率較高、周期較短、重復性高等優點。該造模方法根據移植部位不同分為原位移植和異位移植兩種。原位種植瘤模型維持了原有瘤組織的結構，保持了腫瘤的絕大部分生物學特性，特別是轉移特性[7-9]。因此，本研究選擇原位移植方法建立胰腺原位荷瘤裸鼠模型。

p75NGFR是神經營養因子的低親和力受體，位于17q12-17q22，包括6個外顯子，分子質量為75000[10]。它由1個信號肽、4個半胱氨酸富集的胞外域、疏水的跨膜區及1個富含堿性氨基酸的胞內域組成，與NGF/NTs結合后通過多種功能結構域發生構型改變而發揮作用[11-12]。為了研究p75NGFR對胰腺癌的作用，我們在前期實驗中將p75NGFR全長cDNA導入胰腺癌SW1990細胞，建立了穩定高表達p75NGFR的細胞株p75-SW1990[5]。本研究采用原位移植方法，將p75-SW1990細胞先移植到裸鼠皮下，待成瘤后，取瘤組織二次移植至胰腺組織，結果顯示，該腫瘤的成瘤率較SW1990細胞低、生長緩慢、形成的瘤體較小、侵襲性低、無腹水形成、與周圍組織器官無粘連，體現了p75NGFR抑制腫瘤生長、侵襲和轉移的特性。且通過兩次移植后仍穩定高表達p75NGFR。在移植4周后形成0.3 cm左右的腫瘤，亦完全能夠滿足組織形態學觀察、各種分子生物學的檢測[5],為進一步研究p75NGFR在胰腺癌生長、侵襲和轉移中的作用及其相關機制提供理想的實驗模型。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.021

國家自然科學基金(30770996)

510010，廣州，廣州軍區廣州總醫院病理科(王煒、陳曉東)；第二軍醫大學長海醫院病理科(朱明華、鄭建明、陳穎)

王煒，Email：wangweilv@yahoo.com.cn

2011-11-24)

(本文編輯：呂芳萍)