張松 陳敏 黃淑玲 許春紅 李建琦 王軍 鄒曉平

·論著·

pEGFP-C1-HSP27真核表達載體的構建及其穩定轉染人胰腺癌SW1990細胞株的篩選

張松 陳敏 黃淑玲 許春紅 李建琦 王軍 鄒曉平

目的構建表達熱休克蛋白27(HSP27)的攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的真核載體，建立穩定表達HSP72的人胰腺癌SW1990細胞株。方法采用RT-PCR法從SW1990細胞中擴增出帶有BamH I 、HindⅢ酶切位點的HSP27基因片段，插入真核表達載體pEGFP-C1，鑒定正確后用重組質粒轉染SW1990細胞，并篩選穩轉細胞株。熒光顯微鏡觀察HSP72的定位，RT-PCR、蛋白質印跡法檢測轉染細胞HSP27的表達。結果雙酶切法鑒定和測序證實重組載體pEGFP-C1-HSP27的DNA序列完全正確，并成功轉染SW1990細胞，篩選獲得穩轉細胞株。熒光顯微鏡見EGFP主要分布在胞質中，轉染細胞的HSP27mRNA表達明顯增加(1.458±0.160比0.897±0.051，P<0.05),且表達HSP27與EGFP的融合蛋白。結論成功構建真核表達載體pEGFP-C1-HSP27，并篩選獲得穩轉的細胞株。

胰腺腫瘤； 熱休克蛋白類； 轉染； SW1990細胞株； 基因攜帶體

以吉西他濱作為核心藥物的化療已成為胰腺癌治療的重要策略并可使患者受益[1-2]，但胰腺癌化療耐藥已經成為當前亟待解決的難題。熱休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)，又名熱休克蛋白B1(heat shock protein B1，HSPB1)，是熱休克蛋白家族中的小分子熱休克蛋白亞家族的重要一員。目前，已有研究證實HSP27在食管、胃、肝、胰腺、結腸、乳腺、前列腺、卵巢、膀胱等多種癌細胞中異常高表達[3-5]。同時，多項研究證實在胃癌、直腸癌、肝癌及前列腺癌等腫瘤中HSP27的高表達與腫瘤轉移、不良預后等相關[6-9]。進一步研究表明，HSP27在胃癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌等耐藥細胞株中表達較敏感細胞株明顯升高[10-13]，而HSP27與胰腺癌吉西他濱化療耐藥等相關性及其機制研究鮮有報道。本實驗構建表達增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein，EGFP)與HSP27融合蛋白的載體pEGFP-C1-HSP27，并轉染人胰腺癌細胞株SW1990，為今后研究HSP27對胰腺癌生物學行為的影響奠定實驗基礎。

材料和方法

一、pEGFP-C1-HSP27重組質粒構建

SW1990細胞為本實驗室保存，常規培養。收集對數生長期細胞，應用Trizol提取細胞總RNA。根據GenBank中HSP27 mRNA序列(NM_001540.3)設計引物，上、下游引物的5′端分別引入HindⅢ、BamHⅠ酶切位點和保護堿基，上游為5′-GTTGTCAAGCTTCTGAGCAGACGTCCAGAGCA-3′，下游為5′-GTGGATCCGCATCCGGGCTAAGGCTTT-3′，擴增產物687 bp。引物由上海生工公司合成。先反轉錄合成cDNA，再行PCR擴增。PCR條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min，32個循環，最后72℃ 5 min。產物經電泳分離、鑒定，切膠回收、純化。

HSP27片段和攜帶熒光蛋白EGFP的pEGFP-C1載體(南京鼓樓醫院生殖中心惠贈)行HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，酶切產物經凝膠電泳回收、純化，在T4 DNA連接酶作用下，16℃連接4 h。連接產物轉化感受態DH-5α，在含卡那霉素的LB平板上篩選單克隆并擴增，提取質粒DNA，行雙酶切鑒定及送華大基因生物有限公司測序。重組質粒命名為pEGFP-C1-HSP27。轉化的細菌大量擴增，收集細菌，抽提質粒，置-20℃保存。

二、重組質粒轉染SW1990細胞及穩轉細胞篩選

SW1990接種至6孔板培養。待細胞生長至70%～80%融合時，用無血清培養基饑餓細胞6 h，將pEGFP-C1及pEGFP-C1-HSP27按4 μg質粒∶10 μl LipofectamineTM2000比例分別轉染SW1990細胞，6 h后換無抗生素完全培養基培養48 h，置倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。轉染的細胞分別命名為SW1990-C1及SW1990-HSP27細胞。

應用G418(500 μg/ml)篩選后，利用有限稀釋法將存活細胞接種于96孔板獲得穩轉單克隆，同時用含維持濃度G418(250 μg/ml)的培養基繼續培養28 d，獲得穩轉細胞株。將穩轉細胞株經PBS洗滌及換液后，置于倒置熒光顯微鏡488 nm激發波長下觀察蛋白的表達及細胞定位。

三、細胞HSP27 mRNA和蛋白表達檢測

收集兩轉染組細胞及親本細胞，應用Trizol提取細胞總RNA。先反轉錄獲得cDNA。HSP27特異性PCR引物上游5′-CAAGGATGGCGTGGTGGA-3′，下游5′-TCTCGTTGGACTGCGTGGC-3′，產物197 bp；內參β-actin上游5′-GCCTCGCTGTCCACCTTCCA-3′，下游5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′，產物253 bp。PCR擴增程序同前。

收集上述3組細胞，經裂解液裂解，低溫離心，獲取細胞總蛋白，常規行蛋白質印跡法檢測HSP27蛋白。

四、統計學分析

應用Quantity one、SPASS12.0統計軟件，采用單因素方差分析進行檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、重組質粒的鑒定

目的基因HSP27經擴增后，獲得的片段約687 bp，與設計的目的片段長度相當(圖1)。重組質粒經HindⅢ、BamH Ⅰ雙酶切，酶切產物約679 bp(圖2)，且測序證實無移碼改變，提示重組質粒構建成功。

圖1HSP27基因擴增產物電泳圖(左)圖2pEGFP-C1(2)及pEGFP-C1-HSP27(3)雙酶切后的電泳圖(右)

二、穩轉細胞株的顯微鏡下表現

熒光顯微鏡下，SW1990-C1穩轉細胞表達的EGFP廣泛分布于整個細胞(圖3a)；SW1990-HSP27穩轉細胞表達的EGFP與HSP27的融合蛋白主要分布在胞質中(圖3b)。

圖3pEGFP-C1(a)和pEGFP-C1-HSP27(b)轉染的SW1990細胞(熒光顯微鏡 ×200)

三、細胞HSP27 mRNA及蛋白的表達

SW1990、SW1990-C1及SW1990-HSP27細胞均表達HSP27mRNA(圖4)，表達量分別為0.956±0.066、0.897±0.051、1.458±0.160，SW1990-HSP27細胞的表達水平較SW1990及SW1990-C1細胞明顯增高(P值均<0.05)。

圖4SW1990(1)、SW1990-C1(2)、SW1990-HSP27(3)細胞的HSP27 mRNA表達

SW1990、SW1990-C1、SW1990-HSP27細胞均表達內源性HSP27蛋白，分子質量為27000，SW1990-HSP27細胞還表達HSP27與EGFP融合蛋白，分子質量為54000(圖5)。

圖5SW1990(1)、SW1990-C1(2)、SW1990-HSP27(3)細胞表達的HSP27蛋白

討 論

HSP27作為一種分子伴侶廣泛存在于原核和真核生物中，并可在病理、生理及應激狀態下被誘導表達。HSP27在生物體內存在結構型和誘導型兩種形式。生理狀態下機體表達為結構型HSP27，參與調控細胞增殖、分化以及神經系統的發育等生理過程。在高溫、紫外線、藥物等刺激下，機體表達的是誘導型HSP27，其通過調節細胞死亡的關鍵信號通路、減少活性氧物質形成等多種方式發揮細胞保護作用[14]。Yang等[10, 15]報道，HSP27在耐長春新堿胃癌細胞株SGC790l/VCR中的表達較SGC790l明顯增強，通過反義寡核苷酸抑制HSP27表達可增強SGC7901/VCR中長春新堿和阿霉素化療敏感性。Peng等[12]研究表明，HSP27與結腸癌5-FU耐藥密切相關，沉默結腸癌細胞株LoVo及HCT15的HSP27表達可緩解其對5-FU的耐藥。Baylot等[16]報道，吉西他濱耐藥的胰腺癌細胞株(KLM1-R)高表達HSP27，通過siRNA沉默HSP27表達可恢復其對吉西他濱的敏感性。作者隨訪了11例胰腺癌患者，發現胰腺癌組織高表達HSP27的患者對吉西他濱的敏感性差，且預后不良。

熒光蛋白標記技術是近年來發展迅速的新型細胞示蹤技術。來源于水母的GFP由238個氨基酸殘基組成，分子質量為27000[17]。它在450～490 nm紫外線激發下發出綠色熒光。因其分子質量小、無毒、可形成融合蛋白而不影響配體蛋白功能，目前已成為監測完整細胞和組織內基因表達以及蛋白定位的理想標記物[18]。EGFP是GFP的一個突變體，其熒光強度提高了35倍，應用前景更廣泛[19]。本實驗利用基因重組技術將HSP27基因克隆到EGFP真核表達載體pEGFP-C1，構建的質粒綜合了EGFP的示蹤功能和HSP27的生物學特性，通過脂質體成功轉染人胰腺癌SW1990細胞株，并篩選獲得穩轉細胞株，為進一步研究HSP27與胰腺癌的生物學行為、化療耐藥及耐藥機制奠定基礎。

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ConstructionofpEGFP-C1-HSP27recombinanteukaryoticexpressionvectorandscreeningofhumanpancreaticcancerSW1990celllinestablyexpressingHSP27

ZHANGSong,CHENMin,HUANGShu-ling,XUChun-hong,LIJian-qi,WANGJun,ZOUXiao-ping.

DepartmentofGastroenterology,DrumTowerHospital,NanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing210008,China

ZOUXiao-ping,Email:zouxiaoping795@hotmail.com

ObjectiveTo construct pEGFP-C1-HSP27 recombinant eukaryotic expression vector and establish human pancreatic cancer SW1990 cell line stably expressing HSP27.MethodsRT-PCR was applied to amplify human HSP27 cDNA from human pancreatic cancer SW1990 cells with a pair of specific primers carrying a restriction enzyme site BamH I or Hind Ⅲ on each 5′ end. HSP27 cDNA was inserted into pEGFP-C1 vector and then identified by restriction enzyme digestion and sequencing. Successful constructed pEGFP-C1-HSP27 or empty vector was transfected into SW1990 cells by lipofectamine 2000, respectively. The location of HSP72 was determined by fluoroscopy, RT-PCR and Western blot was used to detect the expression of HSP27 in transfected cell.ResultsThe DNA sequence of pEGFP-C1-HSP27 recombinant plasmid was completely correct, and it was successfully transfected into SW1990 cell lines and stably transfected SW1990 cell lines were obtained, which were confirmed by restriction enzyme and sequencing. The expression of EGFP was distributed in cytoplasm, the HSP27mRNA expression was significantly increased (1.458±0.160vs0.897±0.051,P<0.05). In addition, it was showed that EGFP-HSP27 fusion protein was expressed.ConclusionsThe eukaryotic expression vector pEGFP-C1-HSP27 was constructed successfully and stably transfected SW1990 cell line expressing HSP27 was obtained.

Pancreatic neoplasms； Heat-shock proteins; Transfection; SW1990 cell line； Genetic carriers

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.011

國家自然科學基金(81071816)

210008 南京，南京大學醫學院附屬鼓樓醫院消化科

鄒曉平，Email: zouxiaoping795@hotmail.com

2011-12-10)

(本文編輯：屠振興)