DLL4在胰腺癌組織中的表達及其與腫瘤血管生成的關系

徐桂芳 張偉杰 孫琦 楊軍 周志華 趙海濱 鄒曉平

·論著·

DLL4在胰腺癌組織中的表達及其與腫瘤血管生成的關系

徐桂芳 張偉杰 孫琦 楊軍 周志華 趙海濱 鄒曉平

目的檢測delta-like ligand 4(DLL4)在胰腺癌中的表達，分析其與腫瘤血管生成及臨床病理特征的關系。方法采用免疫組化SP法檢測60例胰腺癌組織及20例癌旁正常胰腺組織中DLL4的表達；觀察微血管內皮細胞CD34表達,計算微血管密度(MVD)；分析DLL4表達、MVD與胰腺癌臨床病理特征之間的關系以及兩者的相關性。結果DLL4在胰腺癌組織中的表達明顯高于正常胰腺組織(68.3%比20.0%,P<0.01)；胰腺癌組織DLL4的高表達與腫瘤分化程度、TNM分型、腫瘤轉移及浸潤等呈正相關(P值均<0.05),而與腫瘤部位、大小、組織病理分型無關。胰腺癌組織MVD明顯高于正常胰腺組織(34.9±13.2比18.9±2.2,P<0.01)；胰腺癌的MVD與腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤轉移及浸潤有關(P值均<0.05)，而與腫瘤部位、大小、組織病理分型等無明顯相關性。DLL4表達陽性的胰腺癌組織MVD明顯高于DLL4表達陰性者(38.8±10.7比29.0±15.2,P<0.05)，且DLL4表達與MVD呈顯著正相關(r=0.669,P<0.05)。結論DLL4表達可促進腫瘤血管生成,且與胰腺癌的轉移、浸潤相關。

胰腺腫瘤; DLL4; 微血管密度; 淋巴結; 腫瘤轉移; 免疫組織化學

Notch信號途徑是由多種分子參與的復雜信號轉導通路, 通過調節相鄰細胞之間信號轉導進而調控細胞發育。在哺乳動物細胞中，Notch信號通路包含5種跨膜Notch配體[Jagged1、2及Delta-like ligand(DLL)1、3、4]和4種Notch受體(Notch1、2、3、4)[1]。其中DLL4作為內皮細胞特異性配體,在血管的新生、發育和成熟過程中起主要作用[2]。本研究檢測胰腺癌組織DLL4表達，探討其與微血管密度(microvessel density, MVD)及胰腺癌病理特征的相關性。

材料和方法

一、研究對象

收集南京鼓樓醫院2000年10月至2002年8月手術切除的胰腺癌標本60例,其中男性42例,女性18例；年齡39～72歲，中位年齡63歲。另取其中20例切除遠端的正常胰腺組織作為對照。病理診斷與分類依據國際抗癌聯合會的TNM臨床分類。

二、DLL4蛋白及MVD檢測

采用免疫組化染色法，按SP超敏試劑盒(KIT29709，福州邁新生物技術開發公司)說明書操作。兔抗人DLL4多抗及CD34單抗購自Abcam公司，工作濃度1∶100；二氨聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)酶底物顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司。用PBS替代一抗作陰性對照。由兩位病理科醫師雙盲法閱片，每張切片選取5個400倍視野，每個視野計數100個腫瘤細胞，胞質中出現棕黃色顆粒為DLL4陽性染色，陽性細胞數<10%為陰性，≥10%為陽性表達。

CD34表達于血管內皮細胞膜,每一個染成棕黃色的、可與周圍血管和腫瘤細胞及其他結締組織區分開來的明顯微小血管腔或含3個以上內皮細胞的內皮細胞簇,不論管腔和紅細胞出現與否,均作為一個單一的、可計數的微血管。管腔面積>8個紅細胞直徑,帶有較厚肌層的微血管均不計數[3]。先于低倍鏡下確定3個血管著色最密集區域,然后在100倍視野下計數3個視野的微血管數目,取均值作為MVD。

三、統計學處理

結 果

一、胰腺癌及正常胰腺組織DLL4的表達

胰腺癌組織DLL4的表達率為68.3%(41/60),正常胰腺的表達率為20.0%(4/20)，兩者差異具有統計學意義(P=0.000，圖1)。胰腺癌DLL4表達與患者性別、年齡及腫瘤部位、大小、組織病理分型均無關，而與腫瘤分化程度、TNM分型、腫瘤轉移及浸潤等呈正相關(P值均<0.05，表1)。

二、胰腺癌及正常胰腺組織的MVD

60例胰腺癌組織的MVD為34.9±13.2,正常胰腺組織為18.9±2.2，兩者差異具有統計學意義(P<0.01，圖2)。MVD與胰腺癌的腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤轉移及浸潤均有關(P<0.05)。而與患者性別、年齡及腫瘤部位、大小、組織病理分型等均無關(表1)。

圖1 胰腺癌(a)與正常胰腺組織(b)DLL4表達(×400)

圖2 胰腺癌(a)與正常胰腺組織(b)的MVD(×400)

表1胰腺癌組織DLL4表達、MVD與臨床病理特征的關系

病理特征例數DLL4陽性[例,率(%)]P值MVD(x±s)P值年齡(歲)0.5280.797 <602818(64.3)33.8±12.6 ≥603223(71.9)35.9±12.9性別0.2110.122 男3421(61.8)34.1±12.1 女2620(76.9)36.0±14.7腫瘤部位0.0950.360 胰頭5137(72.5)35.0±12.6 胰體尾94(44.4)34.3±17.1分化程度0.0220.049 低分化2219(86.4)42.9±8.7 中高分化3822(57.9)30.2±13.2組織病理分型0.1100.329 導管細胞腺癌5135(68.6)35.7±13.5 乳頭狀腺癌75(71.4)31.0±12.1 其他類型癌21(50.0)28.0±7.7腫瘤大小(cm)0.0710.650 ≤2.5115(45.5)31.8±13.1 >2.54936(73.5)35.6±13.2腫瘤累及范圍0.0070.046 T1～T22915(51.7)23.8±4.9 T3～T43126(83.9)45.3±9.4淋巴結轉移0.0130.045 N02412(50.0)29.3±9.8 N13629(80.6)38.6±13.9TNM臨床分期0.0340.038 Ⅰ～Ⅱ2312(52.2)25.0±7.9 Ⅲ～Ⅳ3729(78.4)41.1±12.0

三、胰腺癌組織DLL4表達與MVD的相關性

DLL4表達陽性的胰腺癌組織的MVD為38.8±10.7，DLL4表達陰性的胰腺癌組織的MVD為29.0±15.2，差異具有統計學意義(P=0.038)。胰腺癌組織DLL4表達與MVD呈顯著正相關(r=0.669,P<0.05)。

討 論

文獻報道，血管內皮細胞表達Notch1和Notch4受體及jagged1、DLL1和DLL4配體，且腫瘤血管和腫瘤細胞中也高表達DLL4，并活化Notch信號[4-5]。本結果顯示，胰腺癌組織高表達DLL4， DLL4的過表達與胰腺癌的侵襲和轉移呈正相關，提示DLL4高表達與胰腺癌的惡性生物學行為密切相關。

MVD是衡量血管生成的定量指標。Ikeda等[6]報道，MVD可作為胰腺癌臨床病理改變的獨立預后因素。章福彬等[7]報道，MVD與臨床病理特征關系密切，且與疾病進展階段呈正相關。本結果顯示，胰腺癌MVD明顯高于正常胰腺組織，且與胰腺癌的浸潤、轉移相關，同樣提示MVD與胰腺癌的惡性生物學行為密切相關。本結果還顯示，DLL4高表達與腫瘤組織MVD呈顯著正相關，表明DLL4的表達參與胰腺癌的血管生成過程。

文獻報道，抑制腫瘤組織中DLL4的過度表達將導致腫瘤組織生成大量無功能的新生血管，造成腫瘤組織血供不足，最終導致腫瘤生長受到抑制[8]。抗DLL4抗體也可以特異性阻斷Notch信號通路，抑制小鼠腫瘤生長。因此，DLL4現已經成為腫瘤抗血管治療研究的新熱點。以DLL4為靶目標的抗血管治療技術將為胰腺癌的綜合治療提供新的方法。

[1] Radtke F, Schweisguth F, Pear W. The Notch ‘gospel’. EMBO Rep, 2005, 6:1120-1125.

[2] Schuch G, Kisker O, Atala A, et al. Pancreatic tumor growth is regulated by the balance between positive and negative modulators of angiogenesis. Angiogenesis, 2002,5:181-190.

[3] Boxer GM, Tsiompanou E, Levine T, et al. Immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor and microvessel counting as prognostic indicators in node-negative colorectal cancer. Tumour Biol, 2005, 26: 1-8.

[4] Patel NS, Li JL, Generali D, et al. Up-regulation of delta-like 4 ligand in human tumor vasculature and the role of basal expression in endothelial cell function. Cancer Res, 2005, 65: 8690-8697.

[5] Yan XQ, Sarmiento U, Sun Y, et al. A novel Notch ligand, Dll4, induces T-cell leukemia/lymphoma when overexpressed in mice when over expressed by retroviral mediated gene transfer. Blood, 2001,98: 3793-3799.

[6] Ikeda N, Adachi M, Taki T, et al. Prognostic significance of angiogenesis in human pancreatic cancer. Br J Cancer,1999,79:1553-1563.

[7] 章福彬，朱斌，邵成浩.胰腺導管癌組織中VEGF表達和腫瘤微血管計數的臨床意義.解放軍醫學雜志,2005,30:159-161.

[8] Noguera-Troise I, Daly C, Papadopoulos NJ, et al. Blockade of Dll4 inhibits tumour growth by promoting non-productive angiogenesis. Nature,2006,444: 1032-1037.

Expressionofdeltalikeligand4inpancreaticcanceranditsrelationshipwithangiogenesis

XUGui-fang,ZHANGWei-jie,SUNQi,YANGJun,ZHOUZhi-hua,ZHAOHai-bin,ZOUXiao-ping.

DepartmentofGastroenterology,DrumTowerHospital，NanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing210008,China

ZOUXiao-ping,Email:zouxiaoping795@hotmail.com

ObjectiveTo detect the expression of delta-like ligand 4(DLL4) and its relation with the angiogenesis in pancreatic cancer.MethodsSP immunohistochemistry method was used to detect the expression of DLL4 in pancreatic cancer and para-cancerous tissue. The microvessel density (MVD) was calculated with CD34staining for microvessel endothelium and the correlation between expression of DLL4, MVD and clinicopathological parameters of pancreatic carcinoma was investigated.ResultsThe expression of DLL4 in pancreatic cancer was significantly higher than that in para-cancerous normal pancreatic tissue (68.3%vs20%,P<0.01). The over-expression of DLL4 in pancreatic cancer was positively related to the differentiation degree, TNM staging, metastasis and invasion (P<0.05), but not related to the location, tumor size and histological types. The MVD in pancreatic cancer tissues was significantly higher than that in para-cancerous normal tissues (34.9±13.2vs18.9±2.2,P<0.01). MVD was correlated with the differentiation degree, TNM staging, metastasis and invasion (P<0.05), but not with the tumor size and location, histological types. MVD in pancreatic cancer expressing DLL4 was significantly higher than that in pancreatic cancer not expressing DLL4 (38.8±10.7vs29.0±15.2,P=0.038), and the expression of DLL4 and MVD were positively correlated (r=0.669,P<0.05).ConclusionsDLL4 expression may play an important role in pancreatic carcinogenesis by promoting angiogenesis and may be associated with tumor invasion and metastasis.

Pancreatic neoplasm; Delta-like ligand 4; Microvessel density; Lymph nodes; Neoplasm metastasis; Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.007

南京大學中央高校科研資助項目(021414340038)；南京市青年基金項目(QYK11166)；南京市衛生青年人才培養工程(寧衛科[2011]32號)

210008 南京，南京大學醫學院附屬鼓樓醫院消化科(徐桂芳、鄒曉平)，科技處(張偉杰)，病理科(孫琦、楊軍)；解放軍第101醫院病理科(周志華、趙海濱)

鄒曉平，Email: zouxiaoping795@hotmail.com

2011-10-13)

(本文編輯：呂芳萍)