胰腺癌神經浸潤體外模型的構建與觀察

安薇 李平 李桂香 吳紅玉 金晶 李兆申 賁其穩

·論著·

胰腺癌神經浸潤體外模型的構建與觀察

安薇 李平 李桂香 吳紅玉 金晶 李兆申 賁其穩

目的構建胰腺癌神經浸潤的體外模型，并對胰腺癌細胞的神經浸潤現象進行初步觀察。方法將胰腺癌Capan-2細胞與大鼠背根神經節(DRG)置于Matrigel基質膠中共培養，分別建立以觀察細胞集落面積(模型1)和觀察細胞遷移距離(模型2)為主的兩種模型。倒置顯微鏡下觀察神經突及細胞生長情況，利用圖像分析軟件Image pro plus對圖片進行分析。結果共培養對神經突起生長無顯著影響，無論是共培養還是單培養，DRG神經突均向四周呈放射狀生長。培養模型中，Capan-2細胞朝向DRG方向生長遷移，接著包繞神經突呈紡錘狀，并繼續向DRG爬行。在模型1的共培養組，Capan-2細胞第5天時細胞集落面積為(309.28±19.11)μm2，顯著大于單培養模型的(208.57±7.94)μm2(P<0.01)。在模型2的共培養組，Capan-2細胞第5天時向DRG方向遷移了(284.1±12.9)μm，而空白基質膠一側，細胞遷移距離<150 μm，二者差異具有統計學意義(P<0.01)。結論本實驗成功構建了胰腺癌神經浸潤體外模型，為后續研究打下了良好的實驗基礎。

胰腺腫瘤； 神經浸潤； 體外研究； 神經節，脊； 實驗模型

胰腺癌外周神經浸潤是其術后發生腹膜后轉移的重要原因[1]，也是獨立于其他因素之外影響患者預后的重要因素[2-3]。目前研究認為，神經浸潤是由神經纖維、腫瘤細胞及其微環境之間交互作用的結果，因此，建立類似神經與癌細胞共同生存的微環境尤為重要。Matrigel基質膠是源于Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉瘤溶解的基底膜制劑，能為背根神經節(dorsal root ganglia, DRG)和癌細胞共培養的三維培養體系提供類似體內腫瘤的微環境。本實驗利用Matrigel基質膠，通過DRG與胰腺癌細胞共培養，構建胰腺癌神經浸潤的體外模型，并對癌細胞的神經浸潤機制進行初步探討。

材料和方法

一、Capan-2細胞培養

人胰腺癌細胞系Capan-2由長海醫院消化內科實驗室保存，常規培養傳代。

二、DRG獲取

健康雄性SD大鼠，1～2周齡，清潔級，由第二軍醫大學動物實驗中心提供。參照文獻[4]的方法獲取大鼠DRG，用無菌PBS清洗3次，置無血清培養基中4℃保存。

三、共培養模型建立

模型1：將Matrigel基質膠(BD，USA)置于4℃冰箱溶化過夜，加入100 μl于6孔板孔中央，膠內植入一枚大鼠DRG。取對數生長期Capan-2細胞，用無血清細胞培養液重懸為1×104個/μl的細胞懸液。取10 μl的細胞(1×105個細胞)懸液接種于DRG附近。上述操作于冰上進行。隨后將6孔板置于37℃細胞培養箱孵育30 min，加入3 ml RPMI-1640完全培養液繼續培養。采用同樣方法分別建立Capan-2細胞及DRG的單培養模型。

模型2：取10 μl細胞懸液加入40 μl Matrigel基質膠中，輕輕混勻。在6孔板孔中央加入50 μl的細胞基質膠混懸液，置37℃細胞培養箱內3～5 min，在細胞旁0.5～0.8 mm處放置一枚大鼠DRG，并覆蓋50 μl Matrigel基質膠，另一端則直接加50 μl Matrigel基質膠。隨后將6孔板置37℃細胞培養箱孵育30 min，加入3 ml RPMI-1640完全培養液繼續培養。

上述模型在細胞培養箱中培養6 d，每隔1 d在倒置顯微鏡下觀察胰腺癌細胞的遷移、集落形成及DRG神經突生長的情況并拍照，用專業圖像分析軟件Image pro plus6.0進行分析。參照Ayala等[5]方法，分別在培養第3及第5天于40倍鏡下計算DRG發出的神經突面積，選定區域細胞集落面積及細胞遷移距離。實驗重復3次。

四、統計分析

結 果

一、大鼠DRG的獲取

大鼠DRG位于脊髓側部脊神經后根出椎管處，附著于脊神經后根，大小約1～2 mm，呈米白色，類圓形，表面光滑(圖1)。

圖1 大鼠DRG的獲取

二、體外DRG的神經突生長

DRG神經突的生長無論共培養還是單培養，均呈三維放射狀生長，在下方的神經突可貼壁生長。培養第3、5天時，單培養組的神經突面積分別為(112.3±18.96)μm2和(300.86±17.98)μm2(圖2a)；共培養組面積分別為(115.62±10.55)μm2和(312.20±17.28)μm2，兩組間差異無統計學意義(P值分別為0.808、0.475)。

圖2DRG單培養(a)組的DRG及Capan-2單培養(b)、共培養中單純基質膠一側的Capan-2細胞培養第1(1)、3(2)、5(3)天時的生長情況(×100)

三、體外Capan-2細胞的增殖

在模型1(圖3上)的共培養組，Capan-2細胞于第3、5天時形成的細胞集落面積分別為(183.61±13.77)、(309.28±19.11)μm2，而單培養模型中Capan-2細胞于第3、5天時形成的細胞集落面積分別為(116.1±11.88)、(208.57±7.94)μm2(圖2b)，顯著小于共培養組(P值均<0.01)。Capan-2細胞朝向DRG方向生長遷移，接著包繞神經突呈紡錘狀并繼續向神經節體爬行(圖4a)。

在模型2(圖3下)的共培養組，靠近DRG一側Capan-2細胞貼壁生長，胞體變長，并向DRG方向遷移，當與神經突接觸后則沿著神經突生長(圖4b)，第5天時細胞前端較第1天約遷移了(284.1±12.9)μm；而空白基質膠一側，細胞也貼壁生長，但胞體未延伸變長，遷移距離均<150 μm(圖2c)，二者差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖3共培養模型1(上)、模型2(下)培養第1(a)、5(b)天時的Capan-2細胞與DRG的生長變化

圖4Capan-2細胞與DRG的生長(a)及遷移(b)(×200)

討 論

早期研究認為，胰腺癌細胞主要通過神經周圍及神經束膜內的淋巴系統侵犯神經[6]，然而通過病理對比發現許多患者有神經浸潤但并無淋巴道轉移。隨后，又提出神經間隙學說，即癌細胞沿阻力小的通路侵襲神經。目前的研究結果更傾向于癌細胞與神經相互作用及腫瘤微環境的變化導致神經浸潤的發生[7]。但由于早期的研究缺乏合適的模型反映腫瘤與神經相互作用的微環境，因而阻礙了神經浸潤機制的研究進展。1997年Tonge等[4]成功應用基質膠在體外培育了大鼠DRG，并記錄了其生長的特點，為后續的研究奠定了基礎。Ayala等[5]將大鼠DRG與前列腺癌DU-145細胞在Matrigel基質膠中共培養，構建了新的體外神經浸潤模型，觀察到癌細胞與神經突互逆生長，類似于組織切片所見的神經浸潤過程，提示生長活躍的神經組織可能通過某種方式促進癌細胞浸潤。2007年Dai等[8]將此模型應用于胰腺癌神經浸潤的研究，證實了神經組織、癌細胞及周圍環境之間確實存在交互作用。最近，有研究者在此基礎上分別建立了胰腺癌細胞與DRG及與腸肌叢神經細胞的體外共培養模型，也觀察到神經共培養的環境改變了胰腺癌T3M4細胞的生物學行為[9]。

本實驗建立了胰腺癌Capan-2與DRG體外共培養的兩種模型，結果顯示該兩種模型均出現Capan-2細胞的嗜神經性及神經浸潤的主動性和連續性，并觀察到共培養的環境能促進細胞增殖，然而機制尚不明確，推測神經組織分泌的生長因子可能起到一定作用[8]。但本研究未發現共培養對神經突的生長有明顯的影響。Ceyhan等[9]研究也未提及共培養的環境對神經產生的影響。Ayala等[5]認為，在癌細胞與DRG未接觸前，共培養的神經突較單培養生長快，但共培養到第3天，二者接觸后就產生了抑制，使得神經突生長相對緩慢。

本實驗兩種模型均簡單、易操作，且費用較低，能連續觀察，為進一步研究胰腺癌外周神經浸潤的作用機制提供較好的模型。

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[5] Ayala GE,Wheeler TM,Shine HD,et al.In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction:redefining perineural invasion in prostate cancer.The Prostate,2001,49:213-223.

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[8] Dai H, Li R, Wheeler T, et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer: an in vitro approach. Human Pathol, 2007, 38: 299-307.

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Constructionofmodelsforperineuralinvasioninpancreaticcancer

ANWei,LIPing,LIGui-xiang,WUHong-yu,JINJing,LIZhao-shen,BENQi-wen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

BENQi-wen,Email:benqw0908@126.com

ObjectiveTo establishinvitromodel for perineural invasion (PNI) of pancreatic cancer, and observe the process of PNI.MethodsMouse dorsal root ganglia (DRG) and pancreatic cancer Capan-2 cell line were co-cultured in Matrigel matrix. Two models were constructed: model 1 for observing areas of cell colonies and model 2 for observing distance of cell migration. Neurite outgrowth and cell colony growth were observed by invert microscope, images were analyzed by using Image pro plus software.ResultsNeurite outgrowth was not affected by co-culture. DRG neurite appeared radial growth under either co-culture or single culture. It was observed that Capan-2 cell could migrate to DRG, and grows around the nerve fiber as spindle-shaped, then continue to migrate to DRG. At the 5th day, in the co-culture group of model 1, the colony area was (309.28±19.11) μm2, which was significantly bigger than that in single culture model [(208.57±7.94) μm2,P<0.01]. At the 5 th day, in the co-culture group of model 2, Capan-2 migrated (284.1±12.9) μm to DRG, while in the side of blank Matrigel, cell migrated less than 150 μm, the difference was statistically significant (P<0.01).ConclusionsTheinvitromodels for perineural invasion in pancreatic cancer were constructed successfully, which lay a good foundation for future studies.

Pancreatic neoplasm; Perineural invasion;Invitro; Ganglia,spinal; Theoretical models

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.005

國家自然科學基金面上項目(8107205)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

賁其穩，Email：benqw0908@126.com

2012-03-31)

(本文編輯：呂芳萍)